在做 qPCR 时，你是怎么计算 cDNA 的加入体积的呢？小编也经常收到来自小哥哥小姐姐同样的疑问，那 cDNA 投入多少体积、稀释多少倍，如何去判定投入的量是否准确呢？接下来我们就一起来了解一下吧！
最常见的 2 种cDNA投入量的做法
实验室可能会有一套 SOP，只要按照师兄师姐告诉我们的 cDNA 稀释倍数进行稀释就可以了！
NO.2 使用 Nanodrop 测定 cDNA 的浓度
使用 Nanodrop 测定一下 cDNA 的浓度，按照以往的经验值进行添加 cDNA，或者按照师兄师姐的 SOP 上写到的浓度进行添加。
那这两种做法有什么弊端呢？
首先：不同处理组的 RNA 的表达量是不一样的，如果师兄师姐的 RNA 表达量比较高，例如稀释 1000 倍，CT 值为 25，而您的 RNA 表达量比较低，cDNA 原液投入 CT 值已达到 30，那如果您还按照 1000 倍进行稀释cDNA，那 CT 值已然超出 35 Cycles 了，即便出现扩增曲线，那也是无效的值。
备注：在 SYBR qPCR 中，CT 值超出 35，认为 CT 值是无效的。
如果不稀释，直接用 cDNA 原液做呢？又会面临高表达基因的 CT 值偏小，可能已超出 qPCR 线性范围之外，导致最终定量结果不准确。
其次：使用 Nanodrop 测定 cDNA 浓度是否可行呢？我们先一起了解一下 Nanodrop 测定核酸的原理吧！
核酸是由核糖、磷酸基以及碱基构成。其中，由于碱基含有芳香环结构，因此具有紫外吸收的特性。核酸吸收波长为 260 nm，根据朗伯比尔定律，已知物质的消光系数，液层的厚度，就能利用其吸光度来计算出物质的浓度。
与此同时，280 nm 处可检测蛋白质等；230 nm 处可检测盐离子、去污剂、苯酚、乙醇、糖类等，所以还能通过计算 A260/A280 和 A260/A230 的比值，估计核酸纯度(纯 DNA：A260/A280≈1.7-1.9；A260/A230≈2.0-2.2；纯RNA：A260/280≈2.0；A260/A230≈2.0-2.2)。
但紫外吸收法对溶液的 pH 和盐浓度极为敏感：吸光度本身会受到离子强度以及 pH 这两个因素的影响，所以容易受到杂质的干扰。未纯化的产物 Nanodrop 浓度测定结果会受到 RNA 残留、蛋白残留、盐离子、糖类等物质的影响，导致测定值虚高。
而我们拿到的 cDNA 其实就是一个未纯化的产物，里面有逆转录后残留下来的 Buffer、逆转录酶、引物核酸等，会严重干扰 Nanodrop 对 cDNA 浓度的测定。所以使用 Nanodrop 测定 cDNA 浓度的做法也是不准确的。
可能说到这里，有的小伙伴会有疑虑，既然 Nanodrop 测定未纯化的核酸的浓度会产生虚高的现象，那把 cDNA 纯化一下就 OK 啦？纯化是可以去除杂质，使 cDNA 的浓度测定趋于准确，但是纯化回收的效率并非 100%，定会损失掉一部分核酸，那必然会对后续定量的结果造成影响。
常见的这两种 cDNA 投入量的做法都不是很准确，那应该如何确定 cDNA 的稀释梯度呢？
如何准确确定cDNA的稀释梯度及投入量？
方法一
将cDNA原液做梯度稀释，把得到的不同梯度 cDNA 同时进行 qPCR，选择位于 15-33 范围内的 CT 值对应的 cDNA 稀释梯度作为最佳稀释梯度。如下图所示。（经验值认为，CT 值在 15-33 范围内是准确的）
举个例子：如要扩增某处理组 GAPDH 内参基因，将逆转得到的 cDNA 进行 10 倍梯度稀释，得到的 cDNA 浓度梯度分别为：100（原液）、10-1、10-2、10-3、10-4，将 4 个 cDNA 模板同时上机做 qPCR，得到的 CT 值分别为：12、15.3、18.6、21.9，所以可以选择 cDNA 的最佳稀释梯度为 10-2-10-4，后续再扩增该处理组 GAPDH，就可以选择 10-2、10-3、10-4任何一个梯度。
方法二
若拿到一个之前没有做过的体系，不知道其拷贝数高低时，可以先选择 cDNA 原液进行 qPCR 并得到 CT 值。根据公式：2△CT=浓度差，进行调整最佳 cDNA 稀释梯度。
举个例子：某处理组 GAPDH 内参基因，cDNA 原液上样 1 μl，得到的 CT 值为 10。CT值=10，显然偏小了，要想使该处理组 GAPDH 内参基因的 CT 值为 20，应该如何计算稀释梯度呢？依据公式「2△CT=浓度差」可知，△CT=20（预期 CT 值）-10（实际 CT 值）=10，那浓度差=210=1024，也就是说在 cDNA 原液的基础上稀释 1024 倍即可使该处理组 GAPDH 内参基因的 CT 值达到 20。
不同的体系（基因）、同一基因不同的处理组都需要进行最佳 cDNA 稀释梯度的验证，保证所有的体系的 CT 值都落在 15-33 范围内，可以有效避免因 cDNA 稀释梯度不准确导致 CT 值过小或者 CT 值过大，甚至无 CT 值的情况。
注意：cDNA 原液的添加体积不能超出 qPCR 反应体系的 1/10，如 20 μl qPCR 反应体系，cDNA 原液最多只能上 2 μl，超出 1/10 体系，会对 qPCR 反应产生抑制作用。
有些小伙伴读到这里可能会有疑问了，如果内参基因表达量较高，使用 cDNA 原液 CT 值=11；目的基因表达量较低，使用 cDNA 原液 CT值=32，不管怎么稀释，好像都没有一个可以折中的 cDNA 稀释梯度，这种情况下该如何稀释 cDNA 呢？
有些小伙伴读到这里可能会有疑问了，如果内参基因表达量较高，使用 cDNA 原液 CT 值=11；目的基因表达量较低，使用 cDNA 原液 CT值=32，不管怎么稀释，好像都没有一个可以折中的 cDNA 稀释梯度，这种情况下该如何稀释 cDNA 呢？
极端情况下如何把控cDNA的稀释梯度？
最简单直接的方法就是：目的基因和内参基因分别进行稀释！目的基因减少稀释梯度甚至不稀释，内参基因增加稀释倍数。
接着上面例子，我们可以稀释 512 倍 cDNA 原液，以其为模板扩增内参基因，使 CT 值为 20 左右；继续使用 cDNA 原液扩增目的基因，保证其 CT 为 32。这样就解决掉无法同时兼容内参基因与目的基因的 cDNA 稀释倍数的问题啦！
但这样做的前提条件是：保证所有组的内参基因为相同的 cDNA 稀释梯度，所有组的目的基因为相同的 cDNA 稀释梯度。
为什么可以这么稀释呢？这种方法可行吗？会影响相对定量计算的结果吗？
我们先来回顾一下相对定量的计算公式：
该公式是处理组的△CT值-对照组的△CT值，而△CT=目的基因CT值-内参基因CT值。
① 当目的基因对应 cDNA 不稀释，内参基因对应 cDNA 稀释 512 倍，那目的基因与内参基因的差值（△CT）会存在一个稀释梯度不一致的差值；
② 当处理组的 △CT 值-对照组的 △CT 值时，这个稀释梯度不一致的差值就会被减掉；
③ 所以即便内参基因与目的基因对应的 cDNA 稀释梯度不一致，对计算结果仍然没有影响，稀释梯度不一致的差异最终是会被减掉的。但前提一定要保证我们上述提到的前提条件哦！
磨刀不误砍柴工，小伙伴们一定要确定好 cDNA 稀释梯度后再继续后续的 qPCR，这样才能事半功倍。关于 cDNA 如何稀释的方法，您是否已经掌握了呢？
明确了 cDNA 稀释梯度的方法确实可以帮助我们获得更加准确的实验数据，但是想要做好逆转录和定量实验，选好「武器装备」才是最为重要的。小 V 今天就给大家带来一对「黄金搭档」，在他们的帮助下，不仅可以在短时间内一步获得高质量的 cDNA,同时最终可以获得高平台期的优质定量曲线。话不多说，让我们一起来认识一下他们吧。
产品名称：HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR
产品货号：R333
产品优势
15 min 一步完成基因组清除与逆转录；
cDNA 长久存放无降解：cDNA 可于 37 ℃ 存放 7 天、4 ℃ 存放 4 周、反复冻融 30 次， 依然具有良好的稳定性。
产品名称：Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix
产品货号：Q712
产品优势
超高的扩增平台值：扩增产量大幅度提升，拥有超高扩增平台值
广泛的平台适用性：特殊 ROX 参比材料，适用于所有 qPCR 仪器，无需在不同的仪器上调整 ROX 浓度
