根据研究目的选择合适的模板获取方法，比如做启动子研究需提取基因组DNA、研究某个基因需提取RNA。基因组DNA可直接作为模板扩增获得目的片段，RNA需要逆转录为cDNA再作为扩增模板。

核酸提取作为分子克隆的第一步，模板质量和产量直接影响下游实验结果，接下来从核酸提取的3大步骤来介绍如何获得高产优质核酸。

—左右滑动查看详细步骤—

● 目的片段引物设计与 PCR 扩增

1. 引物同源臂设计要求：15 - 20 bp( 不计算酶切位点 )，GC含量 40%-60%；可使用诺唯赞官网的CE Design 在线软件 (https://crm.vazyme.com/cetool/simple.html)，根据实验需求选择对应模块进行引物设计；

图2. 诺唯赞官网-资源支持-实验工具

2. 建议使用高保真酶进行目的片段的 PCR 扩增，降低突变引入。

● 载体线性化

可使用双酶切或单酶切对载体质粒进行线性化处理。如果没有合适的酶切位点，可选择反向 PCR 扩增获得线性化载体，建议使用高保真酶扩增，降低突变引入，且模板质粒投入量不宜过多（50 μl 投入1 ng），并使用 DpnⅠ对扩增产物消化。

● 目的片段和线性化载体的纯化回收

1. 推荐使用切胶回收的方式纯化（切胶时间最好控制在3 min内，避免紫外照射对 DNA 的损伤），回收浓度使用 NanoDrop/OneDrop 等仪器检测，浓度应当≥20 ng/μl，并跑胶鉴定是否为单一目的条带；

2. 回收浓度低时，可增加 PCR/ 酶切反应体系，多管反应单管回收，提高回收产物浓度。

重组反应体系按照所使用的同源重组试剂盒说明书要求计算投入量，体系中各组分投入体积≥1 μl，若浓度过高可稀释后使用。

1. 连接产物转化的感受态细胞选择使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化学感受态细胞；

2. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例为 1:10；

3. 平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致；

4. 菌液涂板体积：将菌液离心丢弃多余LB培养基，保留100 μl重悬后涂板或不离心吸取合适体积涂板。

● 单克隆菌落 PCR 鉴定

1. 挑取的单克隆菌落体积应大小适中，避免过大或过小；

2. 挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析；

3. 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行 PCR 鉴定。

理想状态的测序信号应当是独立单一的峰形信号，测序信号出现双峰、套峰等情况时，该处碱基信息可信度低，需要其他测序结果共同比对分析。

质粒DNA为共价闭合环状分子，质粒提取试剂盒以碱裂解法居多，通过质粒DNA与染色体DNA在拓扑学上差异来进行分离纯化。

抽提的质粒在电泳检测中多数呈现3条带，根据电泳速度快慢，分别为超螺旋、线性和开环。有时会出现多条带，可能是复制中间体或特殊的DNA序列导致的不同程度的超螺旋所致。

仅需1.5天，即可安全简便获得准确质粒表达载体