图1 单细胞测序和染色验证确定白癜风患者 IFNγ 响应细胞类型

作者使用单细胞转录组测序进行分析患者皮肤中存在的所有细胞类型（图1 a、b），在来自10例白癜风患者和5名健康捐赠者的50,000多个细胞的表达谱数据中分析到8个主要细胞类型（图1 c）。

为了进一步验证IFNγ反应细胞类型，作者分析了白癜风皮损中不同细胞类型中的磷酸化（p）STAT1。在空间上，CD8⁺的密度T细胞与pSTAT1⁺细胞密度呈正相关（图1 d）。定量显示在患者皮肤8种不同类型的细胞中，真皮成纤维细胞占pSTAT1⁺的大部分（约80%）（图1 e , f）。这些数据表明白癜风患者中响应 IFNγ 信号的主要是成纤维细胞。

图2 成纤维细胞分泌趋化因子调节自体免疫的 CD8⁺ T细胞

为了区分成纤维细胞的基本功能是否依赖于细胞间的接触或分泌因子，作者使用了体外T细胞IFNγ处理成纤维细胞的跨孔迁移实验介质（图2 a），确定了28个重叠编码成纤维细胞特异性分泌蛋白的基因，其中5个编码趋化因子，即CCL5、CCL8、CXCL3、CXCL9和CXCL10（图2 b）。在空间上，CD3⁺T细胞的密度与患者皮肤中的CXCL9+ 和CXCL10⁺ 细胞的密度呈正相关（图2 c），且共定位免疫荧光分析显示成纤维细胞约占白癜风患者皮肤中表达的CXCL9和CXCL10细胞总数的80%（图2 d）。另外作者还使用体内成纤维细胞敲除实验，从功能上测试了这些成纤维细胞来源的趋化因子是否参与白癜风发病机制（图2 e）。总之，这些体外和体内的结果表明IFNγ反应性成纤维细胞通过CXCL9/CXCL10–CXCR3介导CD8⁺ T细胞的局部聚集。

图3 不同部位成纤维细胞亚群对 IFNγ 的响应差异决定了器官水平的皮肤自身免疫模式

在整个器官水平上，成纤维细胞的功能具有异质性^[2][3]，但皮肤不同解剖部位的成纤维细胞在调节皮肤免疫细胞的活性方面是否也是不同的尚不清楚。为了研究这一点，作者确定了8个非节段型白癜风患者不同部位的发病频率，发现其中手背、胸部发病率最高，而手掌和手臂发病率最低（图3 a, b）。热图和qPCR分析显示，不同区域特异性成纤维细胞对IFNγ反应上调基因的数量和类型存在显著差异。其中敏感部位成纤维细胞高表达CXCL9和CXCL10基因（图3 c, d），而白癜风模型鼠的背部和腹部表现为部位特异性，都有 CD8⁺T 细胞的富集，且成纤维细胞中CXCL9和CXCL10高表达（图 3 e, f）。作者还用 Transwell 迁移实验和移植实验对不同部位成纤维细胞的响应差异进行了验证（图3 g-i），最后用数学模型和成纤维细胞 IFNγ 通路敲低实验，描述了部位特异性真皮成纤维细胞招募 CD8⁺T 细胞，杀伤黑色素细胞，扩张病变区域的模式和机理（图3 j, k）。

综上所述，本研究通过单细胞测序和转录组分析，结合体内体外实验，首次发现成纤维细胞对皮肤自身免疫病的发生至关重要，描述了成纤维细胞与 CD8⁺T 细胞形成的互作系统在自身免疫病中的关键作用。除白癜风外许多其他自身免疫性皮肤病也表现出具有对称分布的区域偏好^[4][5]，成纤维细胞也普遍存在于我们身体的几乎所有器官中，所以本研究揭示的成纤维细胞与 CD8⁺T 细胞互相作用的调控可以提供一种通用范式，为其他器官自身免疫病发生机制的研究提供借鉴，为理解自身免疫疾病的机理提供了开创性的新思路。

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研究人员通过热图和qPCR分析得到，不同区域成纤维细胞特异性高表达CXCL9和CXCL10基因，确定了CXCL9和CXCL10基因在成纤维细胞调控CD8⁺ T细胞的招募的重要性。在合成qPCR检测物cDNA时均使用该产品进行逆转录。HiScript^® II Q RT SuperMix for qPCR（Vazyme #R222）是以高性价比的HiScript^® II Reverse Transcriptase 为基础的两步法qPCR 试剂盒，比例优化的Random primers/Oligo(dT)23 VN primer mix，使cDNA 合成可从RNA 转录本的各个区域起始并具有相同的逆转录效率，最大程度保证了qPCR 结果的真实性和可重复性。本试剂盒将合成高质量第一链cDNA 所需的所有成分合并为一管5 × SuperMix，只需加入RNA 和水即可进行逆转录反应，使用方便。

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