为了解决传统克隆背景高、酶切位点限制等问题，同源重组克隆强势出圈，用含有同源臂的引物连接载体和插入片段，本应完美解决传统克隆的问题，顺利进行克隆实验，但实际操作过程中还是经常会出现连不上的情况，到底哪里出了问题呢，让我们先从引物这里找找答案吧。

酶切位点：可以保留，可以不保留，根据后续实验需求而定；

特异性引物：进行插入片段的PCR扩增，使得插入片段带上同源臂；

同源臂：利用重组引物的特异性引物片段进行插入片段的扩增，此时插入片段连接了同源臂，后续在重组酶的作用下，将插入片段连到载体上。

其中同源臂是非常重要的部分，它决定着是否能够将插入片段连到载体上。

别着急，设计是这么设计了，但有没有按要求设计呢？

 长度：15-20 bp

 位置：载体序列末端

 GC含量：40%-60%

✦ 同源臂太短（＜13 bp）没有连接活性，连接不稳定，会断开。

✦ 同源臂太长（＞25 bp）重组酶切不到那么多，连不上。

至于GC含量，Vazyme小课堂为你解答。

Buff已加持，接下来就是展现技术的时刻了。