相信各位经常进行分子克隆实验的小伙伴对载体构建实验非常熟悉,通过这项实验,我们能够将自己期望的DNA片段组装到目的质粒,随后经过感受态细胞转化等操作得到重组质粒。实现载体构建的技术方法有多种,如酶切连接法、Gateway克隆、同源重组克隆等,其中Vazyme同源重组方法以其简单、快速且高效的特点,帮助了众多小伙伴顺利完成了载体构建实验。但实验的道路不总是一帆风顺,也会碰到许多问题,其中最常见的是涂板不长克隆。
今天小V带着大家一起探讨这类问题的分析和优化策略,帮助大家在遇到时,能够更好更快的找到原因并合理改进实验。
首先,分析引物设计、线性化载体及目的片段
引物设计
✦建议同源臂长度15-20 bp(酶切位点序列不包含在内),GC含量40-60%,超出范围会影响重组效率
以下图为例解析单片端同源重组引物的设计原则:
载体pUC19,使用限制性内切酶EcoR I、Hind III双酶切方式线性化
灰色框内序列组成:同源重组的同源臂+酶切位点
同源重组引物设计原则(如下图所示)
✦推荐使用CE Design引物设计软件,选择对应模块,按要求输入序列完成引物设计
软件可从下述几种途径获取:
1.登录Vazyme公司官网(http://www.vazyme.com),选择生命科学→资源支持→常用工具→实验工具→CE Design引物设计软件
2.点击下方链接
线性化载体和插入片段
线性化载体和插入片段的长度范围及制备方式
✦插入片段和线性化载体,推荐使用切胶回收方式进行纯化回收(切胶时间最好控制在3 min内)。
✦使用Nanodrop/Onedrop等仪器检测核酸浓度。若浓度小于20 ng/μl,建议多做几管,合并在同一管回收,提高浓度
注:通过凝胶电泳将片段条带与DNA Marker条带的亮度比对估算条带浓度,若实验室的核酸染料为EB染料,可以判断;若为EB替代物,尤其Gelred等大分子核酸染料,不建议使用该方法。Gelred等大分子染料的浓度线性范围和EB不同,对核酸浓度的分辨率不高,不同浓度的核酸条带亮度差不多。
其次,分析重组反应体系和操作
重组反应体系
✦线性化载体和插入片段的使用量
线性化载体和插入片段的最适使用量计算及使用量范围
注:线性化载体和插入片段的区分依靠长度判断,长度最长的片段为线性化载体,其余为插入片段;若计算得到的最适使用量超出对应使用量范围,则使用对应范围的极限值。
✦重组体系各组分的投入体积最好≥1 μl
若投入体积<1 μl,可能因小体积取样不准确影响投入量的准确性(回收产物浓度高时可稀释使用)。
✦重组体系建议按说明书配制
C112、C113体系总体积为20 μl,C115体系总体积为10 μl。
✦进行阳性对照反应,排除其他实验材料及操作因素的影响
使用试剂盒中提供的线性化载体和插入片段,按说明书配制重组反应体系。
重组反应程序与环境
✦反应程序
37℃,30 mins(C112、C113),同源臂GC含量偏高时可改为50℃,15 mins;
50℃,5 mins(C115单片端重组),DNA总量300-400ng时改为50℃,15 mins;
50℃,15 mins(C115多片段重组),4-5个片段重组时改为50℃,30 mins。
注意
事项
✦反应建议使用PCR仪进行。水浴锅等常规仪器对温度控制不精确(尤其37℃),影响重组效率。
最后,分析感受态细胞转化与涂板操作
感受态细胞转化
✦感受态细胞的选择:选用克隆用化学感受态细胞,不可选择电击感受态
DH5α、FastT1适合≤15 kb质粒转化;XL10适合>10 kb质粒转化。
✦重组产物与感受态细胞用量
重组产物体积:感受态细胞体积=1:10,推荐10 μl重组产物+100 μl感受态细胞。
涂板操作
✦抗生素抗性:平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致。
✦菌液涂板体积:建议将菌液离心,移液枪吸取丢弃多余LB培养基,保留100 μl重悬,全部涂板。
如果屏幕前的你对于同源重组实验还有问题,不妨动动手指在下方评论区留言,小V期待与你相遇。