miRNA（microRNA）是片段长度约在21 ~ 23 nt的内源性非编码小RNA，由于其长度很短，对miRNA进行qPCR定量时，无法直接对其进行正、反向引物的设计（通常正向引物就足以覆盖miRNA全长），因此需要miRNA专用的逆转录试剂盒，通过增加逆转录产物长度来解决这一问题。

在进行miRNA实验之前，是否会有这样的疑惑呢：如何增加miRNA逆转录产物长度？定量的引物如何设计？内参如何选择？针对这些问题小V在这里为您答疑解惑。

● 如何增加miRNA逆转录产物长度？

增加miRNA逆转录产物长度的方法有茎环法和加尾法这两种方法，茎环法通过设计茎环逆转录引物（由茎环结构和miRNA的3’末端六个反向互补的碱基组成），茎环逆转录引物首先与miRNA的3’末端结合，在逆转录酶的作用下进行反应，获得人为加长的miRNA第一链cDNA。加尾法首先通过Poly（A）聚合酶（PAP）向miRNA的3’末端添加Poly（A）尾，然后在逆转录酶的作用下，结合逆转录引物（由3’端带有锚定碱基的Oligo dT序列和一段通用序列组成），即可获得加长版的cDNA。

miRNA茎环法逆转录原理图

miRNA加尾法逆转录原理图  

● miRNA茎环法 VS miRNA加尾法：

● miRNA推荐使用的内参：

small nucleolar RNA（snoRNA）长度约为60 ~ 300 nt左右，在多种组织细胞中高表达，不涉及miRNA的调节途径，所以snoRNA是很好的内参选择。研究证实常用的snoRNA assays包括：

Human：U6、RNU48、RNU44、U47；

Mouse：U6、snoRNA-202、snoRNA-234、snoRNA-420；

还有一类是在不同实验条件下变化差异很小的miRNA：

Human/mouse tissues：miR-152、-186、-25、-92、-26b、-16；

Human/mouse cell lines：miR-374、-16、-93、-186、-26b；

还有一类是传统沿用的18S rRNA or U6。

● 目的基因的逆转录引物和qPCR引物如何设计？

Vazyme为您提供茎环法miRNA专用试剂盒Vazyme #MR101，后续定量时需搭配使用miRNA定量反应的专用预混液Vazyme #MQ101。

1、逆转录引物设计：

Vazyme为您提供专属茎环逆转录引物设计软件，只需输入miRNA序列后点击设计引物，即可得到逆转录引物序列及qPCR引物序列。

2、正向引物设计：

建议将miRNA序列除去3’末端6个碱基的剩余部分作为miRNA正向特异性引物，并将其中的U替换为T。因为miRNA的3’末端6个碱基和茎环法逆转录引物是碱基互补的，若在设计定量上游引物的时候，没有避开了miRNA的3’末端6个碱基，上游引物有一定机率会与茎环逆转录引物结合，可能会出现非特异性扩增。Vazyme #MQ101在配制qPCR混合液时的Specific Primer 组分即为自己设计合成的正向引物。

3、反向引物由Vazyme #MQ101提供：

Vazyme #MQ101中的mQ Primer组分即为miRNA的qPCR反向通用引物，其序列为茎环逆转录引物中茎环结构序列的一部分。

● 内参的逆转录引物和qPCR引物如何设计？

以常用的U6内参为例，U6的序列足够长，因此不需要设计茎环引物（当内参产物长度在80 bp以上时就不需要设计茎环引物），U6在逆转录的时候投入qPCR下游引物即可，U6在逆转录时投入的qPCR下游引物是当做逆转录的特异性引物去逆转的，后续qPCR定量的时候还是要正常投入上下游引物。

常规qPCR引物设计原则：

产物长度80 ～ 200 bp、3’端应尽量避免高GC或高AT含量区域、正反向引物的Tm值最好相差不要超过1 ℃、GC含量（40 % ～ 60 %）。

适用于小鼠和人样本的U6内参qPCR引物为：

Forward primer：CTCGCTTCGGCAGCACA

Reverse primer：AACGCTTCACGAATTTGCGT

● miRNA采用茎环法进行逆转录时，可以在一管中同时添加多个逆转录引物吗？

不可以。茎环法逆转miRNA，一管反应中只能逆转内参或者一个miRNA，不同引物需要分管逆转。在一管中同时投入多个茎环引物进行多个miRNA逆转时，不同特异性茎环引物的茎环结构之间会产生相互干扰和影响。

● 目的基因的逆转录引物和qPCR引物如何设计？

1、逆转录引物由Vazyme #MR201提供：

Vazyme #MR201中的RT Mix组分包含了逆转录引物，因此不需要单独设计。

2、正向引物设计：

① 建议根据完整miRNA序列设计miRNA正向特异性引物，并将其中的U替换为T。

② 因为决定miRNA特异性的差异碱基大多都在3’端，基本上同家族的miRNA在5’端序列相近，若根据miRNA序列设计的正向特异性引物退火温度过低，建议在引物5’端增加几个碱基（以G和C为主），增加碱基后需要验证一下特异性是否发生变化，以免造成非特异性扩增。若引物退火温度过高，建议删去5’端几个碱基。

③ 对于miRNA前体等长片段非特异性扩增，建议在正向特异性引物3’端增加1 ~ 3个A碱基。因为miRNA前体的部分序列和miRNA的序列是一样的，唯一的区别就是Poly（A）聚合酶发挥作用之后，miRNA序列后有连续A碱基组成的Poly（A）尾，而miRNA前体中与miRNA一致的序列后面不是连续的A碱基。在后续定量时，上游引物3’端增加1 ~ 3个A碱基可以避免miRNA前体的非特异扩增。

④ 对于序列相似的miRNA，决定其特异性的差异碱基大多都在3’端，建议正向特异性引物3’端需要终止于差异碱基，若由于引物长度过短而导致退火温度过低，可在引物5’端增加几个碱基，使上下游引物Tm值匹配。

3、反向引物由Vazyme #MR201提供：

Vazyme #MR201提供用于qPCR检测的反向通用引物Universal reverse Q primer，退火温度约为60 ~ 66℃。

以hsa-miR-107为例，其miRNA 序列为：AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA

Forward primer：AGCAGCATTGTACAGGGCTATCA

Reverse primer：Vazyme #MR201中提供qPCR下游引物Universal reverse Q primer

● 内参的逆转录引物和qPCR引物如何设计？

加尾法逆转录可以对提取纯化的所有mRNA和miRNA进行无差别加尾，因此不需要对内参做单独处理。

适用于小鼠和人样本的U6内参qPCR引物为：

Forward primer：CTCGCTTCGGCAGCACA

Reverse primer：Vazyme #MR201中提供qPCR下游引物Universal reverse Q primer

Vazyme为您提供miRNA专用的RT-Q系列产品，并搭配最适miRNA引物设计软件，可直接进行成熟miRNA的实时荧光定量PCR高效检测。

● miRNA茎环法系列产品

● miRNA加尾法系列产品