接头作为文库构建中必不可少的一部分，随着高通量测序技术的日益发展，也在不断的更新。面对市场上令人眼花缭乱的、不同种类的接头，大家是否会茫然无措，不知如何选择呢？接下来就跟随小编一起，盘一盘接头的那些事儿。
接头是建库过程中在DNA片段两端加上能够与测序仪配合测序的一段核苷酸序列。如下图所示为一个完整的双端Index文库，其中蓝色框标记的为接头。
图1. 文库的一般结构
小编大致将这些接头分了以下几类：
①根据Index位置的不同，接头可以分为单端接头和双端接头。
单端接头：只在P7端存在Index序列；
图2. 单端Index示意图
双端接头：P5和P7两端均存在Index序列；
图3. 双端Index示意图
一般而言，Index序列的碱基数为6 nt或8 nt。以8碱基Index序列为例，单端Index组合理论上可以有48种，双端Index组合理论上可以有416种。考虑到测序时Index组合要满足碱基平衡和激光平衡原则，实际可供选择的Index种类为数不多。但总体来说，双端接头的种类依旧远远多于单端接头，所以大家可以根据自己的样本量的大小来选择单/双端接头。
② 根据能否构建PCR-free文库，接头又可以分为完整接头和不完整接头。
图4. 完整接头与不完整接头的不同扩增方式
完整接头通过TA连接的方式连接到待测DNA片段两端，在文库产量足够的情况下，可不进行PCR扩增直接上机测序，即可构建PCR-Free文库；
不完整接头通过TA连接的方式连接到待测DNA片段两端后，必须使用与短接头互补的Indexing Primers进行PCR扩增成为完整接头后，才能上机测序（小编在此要敲黑板了！使用不完整接头时，文库扩增阶段一定要使用的是接头试剂盒中的含有index序列Primer，而不是不含index序列的通用Primer）。
③ UDI ＆ UMI
为了解决Patterned Flow Cell（Hiseq系列、Novaseq等）中凸显的标签跳跃问题，Illumina提出了“Prepare dual Indexed libraries with unique Indexes”的策略，即在文库的P5和P7端带上独特的标签—UDI（Unique dual Index），采用P5与P7端Index一一对应成组设计的方式，两端交叉验证，能够有效降低Index错误分配的现象。
图5. UDI解决标签跳跃与错配问题
为了从cfDNA中找到低频突变、避免假阳性，引入UMI（Unique Molecular Identifiers）——通过对原始DNA分子片段进行标记，验证测序结果在原始DNA序列上的一致性，进一步剔除假阳性突变，提高低频突变检出。
图6. UMI助力低频突变检出
如上图6-（1）所示，建库扩增或者测序过程中部分碱基发生了突变（标红的碱基），这部分突变其实就是假阳性突变。当经过UMI校正后，这两个假阳性突变可以被剔除掉。而图6-（2）中当真实的低频突变（最右侧的T）与假阳性突变（标红的碱基）同时存在时，通过UMI矫正，不仅保留真实突变（最右侧的T），也可以剔除假阳性（标红的碱基），从而提高了低频突变检出的准确性。图6-（3）中，当不含UMI标签时，无法对真实的突变（最右侧的T）与假阳性突变（标红的碱基）进行区分，最后会得到很多可能的序列，但这些序列并不能反应样本的真实情况。
关于UDI&UMI的具体原理都整合在这一篇推文里<UDI＆UMI的相关介绍传送门：上新品 | 肿瘤低频突变检测必备利器——双端UDI UMI接头>。
Index/Barcode 的选择是一门技术活。如果Index/barcode 组合不佳,标签序列测序质量下降，部分或者全部标签碱基识别不正确，将导致部分数据无法归属到任何一个样本，成为 undetermined数据，造成浪费。
为此，我们重磅推出Index平衡小工具。双平台通用（Illumina平台与华大平台），根据自己的文库数量，选择所用的接头货号，或者自主输入Index序列，2-3 min即可出结果，是不是超级方便！
使用方法附上——登录网址：http://cloud.vazyme.com:83，工具栏搜索 “BARCODE_INDEX_SELECT_2.0”，进入小工具（就是下图7），页面右侧附有使用说明，在使用过程中如遇到任何问题欢迎咨询身边的诺唯赞人。
图7. Index平衡小工具
详细内容参考往期推文<Sample sheet填写传送门：干货 | NovaSeq测序试剂的Sample sheet填写，你学废了吗？>
Vazyme现有的搭配Illumina平台的测序接头填写参考：
正确填写Index信息，不仅可以避免我们数据拆分时出现正反向拆分的重复性工作，而且也能够避免因Index方向填写错误而造成不同文库之间的污染。
最后，小编要隆重推出一本手册——NGS接头产品手册，该手册中包含Vazyme的所有接头产品及相关信息，也包含一部分的接头知识简介，如有需要，可以联系您身边的诺唯赞人。
