RT-qPCR是分子生物学的基础实验，想必大家都很熟悉了，主要包括三大步骤：RNA提取、逆转录成cDNA以及实时荧光定量PCR，但有时下机数据不理想，重新跑了几板也无济于事，到底是怎么回事呢？很可能是逆转录实验出了问题！虽然看起来逆转录实验只需将RNA、dNTP、引物、逆转录酶加入离心管中混匀，进行反应即可，但是在实际操作过程中，还是有很多细节需要注意。下面就跟小V一起来了解一下吧！
想要获得cDNA，RNA的质量很关键！RNA质量主要可以从两个方面进行检测：
（1）RNA完整度：可以通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适当加大模板投入量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取。Agilent 2100以峰图和RIN值来指示RNA的完整性。若核酸完整，则峰图基线平整；若核酸降解严重，则基线不平并出现较多降解峰；RIN数值大小即反映RNA的完整性，在0-10区间范围内，数值越大表明RNA质量越好、完整度越高。小V悄悄告诉你，如果RNA部分降解，也不是完全无药可救，Vazyme三代逆转录产品——Vazyme #R312/R323/R333，对于部分降解的RNA仍有较高的逆转效率。
（2）RNA的纯度：可以通过紫外分光光度法来检测OD260/280的比值，若OD260/280比值在1.9~2.1之间说明纯度很好。
在进行RNA提取时，我们得到的RNA中可能会混入未被清除干净的基因组DNA（gDNA），因此，逆转录之后的cDNA中也会混有gDNA。在进行下游qPCR实验反应时，cDNA和gDNA可能会被同时扩增，以致CT值偏小，因此结果可能会存在偏差。
那这种情况怎么办呢? 小V建议：
（1）对逆转的RNA进行基因组清除处理，基因组清除可以在RNA提取时使用柱提法进行去除；
（2）使用DNaseⅠ处理提取后的RNA，但要使用EDTA终止；
（3）直接使用带有基因组清除模块的逆转录试剂；Vazyme #R223/R233/R323/R333均带有基因组清除模块，更有Vazyme #R333可以一步完成逆转录反应与基因组清除反应，减少反应程序，使您的实验更方便、更快捷。
（1）特定转录本：推荐使用基因特异性引物；
（2）长片段转录本：推荐使用Oligo dT/基因特异性引物；
（3）长片段转录本的内部片段：基因特异性引物 /随机引物/随机引物+Oligo dT，若后续为qPCR实验，不可单独使用Oligo dT，因为单独使用Oligo dT可能会产生3’端偏好性，导致qPCR实验结果不准确；
（4）miRNA：可以选用茎环法引物或加尾法引物。
获得逆转录产物cDNA后，cDNA应该稀释多少倍进行qPCR实验很重要，cDNA浓度太高或太低都可能会影响扩增效率，那cDNA是否可以测浓度，应该怎么做呢？
（1）逆转录产物cDNA不可测浓度，因为逆转录产物中除了cDNA产物以外，还含有逆转录残留的Buffer、逆转录酶、引物等，会干扰浓度测定结果，同时引起OD260/280、OD260/230比值异常，因此不能反应真实的cDNA产量。这个时候会有小伙伴说，那我纯化后再测浓度；这里小V要提醒一下，cDNA不建议纯化，因为逆转得到的cDNA长短不一，纯化会损失短的cDNA。
（2）那么究竟要怎么办呢？qPCR实验前，可以通过预实验确定cDNA的稀释梯度。例如：使用cDNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液作为模板进行qPCR实验，选择CT值落在18-28范围内的稀释倍数。
miRNA是一种不编码蛋白质的，大小约为22 nt左右的单链小分子RNA。因其长度比较短，常规的qPCR法很难对其直接定量，因此经常需要延长miRNA；现在常用的对miRNA的逆转录方法有茎环法和加尾法。
茎环法是通过添加茎环引物的方法来延长miRNA，这种检测方法的灵敏度和特异性更高，但检测通量低，一次逆转录仅能检测一个miRNA和内参；加尾法是由两个酶共同作用完成的，它们分别是PolyA聚合酶和逆转录酶。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾，增加其长度，逆转录酶进行逆转录反应，这种方法的检测通量高，一次逆转录即可检测多种miRNA及内参，但灵敏度和特异性低于茎环法。
Vazyme #MR101和Vazyme #MR201分别为针对miRNA逆转录的茎环法和加尾法试剂盒。其中Vazyme #MR201配以优化的缓冲体系和定向改造的逆转录酶，在保证具有高灵敏度的同时，较大限度降低了miRNA前体的逆转录，保证逆转录特异性，使您的实验结果稳定可靠。
活动时间：9月1日-9月30日
Vazyme #R333（一步法逆转录试剂盒）特点：
Vazyme #MR201（miRNA加尾法逆转录试剂盒）特点：
