书名：现代骨组织修复材料及其评价  
定价：70.0  
ISBN：9787030400642  
作者：廖晓玲等  
版次：1  
出版时间：2014-03  

内容提要：  
现代骨组织修复材料是一类重要的生物组织工程材料，其评价技术已成为当代生物材料发展的关键。本书根据作者科研团队的研究基础及成果，着重介绍了现代骨组织修复材料的种类、制备、结构、组织诱导性、测试技术以及应用。全书共8章：第1章生物材料与骨组织修复；第2章纳米磷酸钙生物陶瓷材料；第3章碳生物医用材料;第4章软骨重建生物材料;第5章生物材料生物相容性评价;第6章蛋白吸附评价;第7章共聚焦显微镜技术;第8章FRET活细胞分子信号检测技术。  

目录：  
前言 第1章生物材料与骨组织修复1 1.1引言1 1.2骨细胞及其骨修复1 1.2.1骨组织及其细胞组成1 1.2.2骨的吸收、形成与修复的生理过程2 1.2.3间充质干细胞3 1.2.4骨组织工程中的生物材料4 1.2.5三代骨修复材料5 1.2.6骨组织工程中的间充质干细胞6 1.3物理/机械环境对骨细胞功能的影响7 1.3.1孔隙度与孔尺寸对支架的影响7 1.3.2支架表面物理性质的影响8 1.3.3环境机械性质的影响9 1.3.4应力负荷的影响10 1.4总结与展望11 参考文献11 第2章纳米磷酸钙生物陶瓷材料18 2.1纳米磷酸钙粉体制备工艺及影响因素18 2.1.1干法合成19 2.1.2水热合成法19 2.1.3湿法合成21 2.1.4小结25 2.2纳米磷酸钙骨组织工程支架材料26 2.2.1单相纳米磷酸钙支架材料26 2.2.2双相纳米磷酸钙复合支架材料28 2.2.3纳米磷酸钙/聚合物复合支架材料28 2.2.4纳米磷酸钙基骨组织工程支架材料发展趋势31 2.3纳米磷酸钙骨组织工程支架材料生物学效应32 2.3.1纳米骨组织工程支架材料对蛋白吸附的影响33 2.3.2纳米骨组织工程支架材料对细胞的影响34 2.3.3纳米骨组织工程支架材料的生物学风险39 2.4小结39 参考文献40 第3章碳生物医用材料48 3.1碳/碳复合材料简介48 3.1.1碳/碳复合材料的研究历史及应用现状48 3.1.2碳/碳材料的微观结构50 3.2碳生物医用材料54 3.3碳纤维及其复合生物材料58 3.3.1多孔碳纤维增强聚乳酸与壳聚糖的复合生物材料59 3.3.2碳纤维分散效果分析60 3.3.3冷冻温度对多孔支架形态与孔隙率的影响60 3.3.4支架的细胞相容性评价64 3.3.5结论66 参考文献66 第4章软骨重建生物材料73 4.1关节软骨的结构与功能73 4.1.1关节软骨的板层结构73 4.1.2软骨细胞与细胞外基质74 4.1.3关节软骨的生物力学性能76 4.2关节软骨损伤与临床修复76 4.3组织工程化软骨重建77 4.3.1软骨组织工程的基本原理77 4.3.2软骨重建生物材料的仿生设计80 4.3.3软骨支架材料的生物性能85 参考文献91 第5章生物材料生物相容性评价99 5.1生物材料生物相容性评价发展趋势99 5.1.1材料反应100 5.1.2宿主反应101 5.2传统的生物相容性评价101 5.2.1细胞毒性102 5.2.2致敏102 5.2.3刺激102 5.2.4皮内反应103 5.2.5全身毒性(急性）103 5.2.6亚慢性毒性(亚急性毒性）103 5.2.7遗传毒性103 5.2.8植人104 5.2.9血液相容性104 5.3分子生物学在生物相容性评价中的应用108 5.3.1研究模型109 5.3.2主要方法109 5.3.3分子生物学在生物相容性评价中的应用115 5.4小结120 参考文献120 第6章蛋白吸附评价123 6.1与骨形成有关的蛋白质123 6.1.1纤维连接蛋白123 6.1.2玻璃体结合蛋白125 6.1.3骨生长因子126 6.2蛋白吸附的研究方法132 6.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳133 6.2.2质谱分析134 6.2.3X射线光电子能谱134 6.2.4椭偏法135 6.2.5原子力显微镜136 6.2.6石英晶体微天平137 6.3生物材料蛋白吸附研究进展138 6.3.1蛋白质结构及性质与蛋白吸附139 6.3.2生物材料表面特性与蛋白吸附142 6.3.3蛋白和基体材料的相互作用143 6.3.4纳米生物材料对蛋白特异性吸附144 6.4小结146 参考文献146 第7章共聚焦显微镜技术157 7.1基本原理和主要部件157 7.2操纵步骤及注意事项163 7.3组织重建中的主要应用164 7.3.1材料的细胞相容性检测164 7.3.2重建细胞-材料3D结构167 7.3.3体内组织重建的荧光成像169 7.4全内反射荧光显微术检测膜蛋白运动170 7.4.1全内反射荧光显微镜技术171 7.4.2活细胞中生物单分子探测173 7.4.3荧光探针及标记方法173 7.4.4质膜蛋白质复合物组学研究176 7.4.5质膜蛋白质复合物图像研究177 参考文献180 第8章FRET活细胞分子信号检测技术187 8.1简介187 8.2荧光蛋白188 8.2.1野生型GFP188 8.2.2野生型GFP衍生物及其他的短波长荧光蛋白188 8.2.3DsRed及其衍生物，以及其他具有相对较长波长的荧光蛋白191 8.2.4光激活/光转化荧光蛋白193 8.2.5环化后序列改变荧光蛋白196 8.2.6其他的荧光蛋白197 8.3依赖荧光蛋白的影像技术198 8.3.1荧光共振能量转移技术198 8.3.2荧光寿命成像显微术200 8.3.3检测分子运动的显微技术200 8.3.4生色辅助光失活202 8.4生物力学研究中用荧光蛋白作为标记分子202 8.4.1细胞器的定位和形态变化203 8.4.2监测细胞骨架的动态变化204 8.4.3胞内信号分子的动态示踪204 8.4.4监测基因表达207 8.5FRET的应用研究207 8.5.1生物力学中的信号时空定量208 8.5.2光脱色荧光恢复在力学生物学研究中的应用211 8.6荧光蛋白在力学生物学研究3D环境中的应用211 8.7结论和展望212 参考文献213  

在线试读：  
第1章生物材料与骨组织修复 1.1引言 骨骼是脊椎动物的重要结构，由60%的羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)、10%的水和30%的胶原蛋白构成，在提供运动机械支撑、保护重要器官以及调节钙、磷代谢中起到重要作用。以上功能的持续完成需要健康的骨系统［1］，然而在世界范围内，许多人存在着骨质缺损现象。其诱因多种多样，包括外科创伤、肿瘤、骨疾病、先天缺陷和老龄化等，这些问题占据了骨科(orthopedics)临床病例中的绝大多数。因此，骨修复已成为临床治疗相关研究中的焦点。 骨修复方面的*新进展显示，以组织工程的支架材料与细胞联合培养的杂化结构(hybrid cell-material structures for tissue engineering)为微创外科手术提供了一种独特的自我修复技术。这些杂化结构中的细胞来源于患者本身的干细胞（大部分来源于骨髓），在体外仿生环境下进行增殖并分化成不同细胞，再生出新的骨组织，而支架材料自身随着新骨的再生而降解［2］。新的骨组织再生过程由骨细胞调控，而骨细胞的功能变化又严格受微环境（包括生化试剂、支架材料理化特性和生物力学等刺激）的影响［3,4］。 基于此，本章主要介绍骨组织在再生及修复过程中，不同机械/物理微环境下对骨细胞生理机能的影响，包括骨组织的细胞构成、骨增生或修复过程的生理机制以及骨组织工程中生物材料的发展与要求。同时，从生物支架材料的理化特性对骨细胞功能影响的角度上，阐述骨细胞生理学及其再生过程，显示细胞对机械环境诱因的响应。在本章的*后，简要描述了当代骨组织再生研究中的*新进展与未来研究方向中尚待解决的问题。 1.2骨细胞及其骨修复 1.2.1骨组织及其细胞组成 骨结构包含了不同来源的细胞［4］。骨的多细胞结构由从内到外的四部分组成：骨髓、骨内膜、多孔矿化骨组织(porous mineralized osseous tissue)和骨膜(沿着骨外表面的膜)，如图1.1所示。 图1.1骨骼多细胞结构的简单示意图（不包括血管和神经组织） 骨髓中存在造血干细胞（HSCs）和间充质干细胞（MSCs）。骨内膜位于骨髓腔和骨松质网的壁上，包括成骨细胞（分泌基质和矿化的特定细胞）和破骨细胞（主要职能是骨吸收）的祖细胞。在骨组织中存在着丰富的矿化骨基质和五种细胞：①骨母细胞（osteoprogenitor），包括成骨细胞和破骨细胞的祖细胞（progenitor）；②成骨细胞；③骨细胞（osteocytes)，成骨细胞的衍生物；④破骨细胞；⑤骨衬细胞（bone-lining cells）,不活跃的成骨细胞，可以被机械刺激重新激活［5,6］。其中，骨细胞和骨衬细胞*为丰富。骨细胞位于骨基质内的空隙中，而骨衬细胞则覆盖在骨表面［4,6,7］。另外三种细胞则位于松质骨的骨小梁表面（trabecular surface）或密质骨骨组织中的中央管（Haversian canal）表面。骨膜和骨内膜在骨的形成、生长和再建中有着重要作用。 1.2.2骨的吸收、形成与修复的生理过程 根据Albright的代谢平衡原理［8］，人类的骨组织结构依赖于骨吸收与骨重建之间的动态平衡。这两个过程受骨动态平衡的调控，时时刻刻发生在骨组织不同位置，吸收掉旧骨更换为新骨［8,9］。骨吸收与骨重建间的不平衡会导致某些骨疾病的发生，如骨质疏松症（OP）和骨关节炎（OA）［4,10,11］。成骨细胞形成新骨后，成熟的破骨细胞将再吸收旧骨。这种动态平衡下再吸收和再重建过程的耦合贯穿了骨的全部寿命。例如，每年成熟的骨连续重塑的比率达10%左右［9,12］。因此，骨组织工程中的理想支架材料需要使类似的再吸收/再生过程得以重现。在骨修复过程中，由骨髓造血干细胞分化成新破骨细胞的祖细胞或原破骨细胞祖细胞，通过循环系统进入愈合位点（healing site）并彼此融合成为成熟的破骨细胞。其间，骨髓间充质干细胞回游到愈合位点，分化成软骨细胞（生成软骨）和成骨细胞。骨骼有缺陷的部分被破骨细胞介导的再吸收隔离，并被分泌的新骨基质代替，随后成骨细胞使其矿化。新的骨组织由矿化的骨细胞和骨衬细胞保护［4,9,12］。同时，破骨细胞也可调控成骨细胞前体细胞的分化、造血干细胞的转移以及炎症、肿瘤过程中细胞因子的分泌。受损骨组织的重建过程如图1.2所示，其中包含了多个彼此协调的阶段［12-15］。 图1.2受损骨组织的重建过程（不包括血管化过程） （1）骨膜的再生。骨膜内的纤维母细胞（fibroblasts）开始分裂以产生足够多的细胞形成新骨膜，闭合受损缺口的表面。 （2）再吸收过程。骨髓中的HSCs分化成破骨细胞前体细胞进入循环系统移动到受损部位,并且在骨组织、骨膜和骨内膜中骨母细胞的作用下，彼此混合成成熟的破骨细胞［12］。成熟的破骨细胞是多核的、类似巨噬细胞的细胞，在成骨细胞的影响下可以启动受损骨骼边缘钙化基质碎片的再吸收过程。 （3）重建过程。破骨细胞再吸收之后，MSCs和骨母细胞受到刺激从而向治愈位点移动并且分化成软骨细胞和成骨细胞以形成新的骨组织。新的骨组织由软骨类骨质基质（cartilage osteoid matrices）构成，之后则会被矿化的成熟骨细胞代替。新形成的骨组织通常称为“纤维骨”（woven bone），仍需要不断重复再吸收及重建过程才能形成成熟的骨组织。 再生过程涉及多种细胞，包括HSCs、MSCs、骨母细胞、破骨细胞、成骨细胞、骨细胞和纤维母细胞，它们都源自骨髓、骨组织、骨膜和骨内膜。 1.2.3间充质干细胞 MSCs是衍生自任何组织间质起源的前体细胞，既可以分化（产生可以执行特定功能的成熟子细胞）又可以自我更新（维持并充满干细胞库（stem cell pool）），在发育期的组织构建中发挥着重要作用。有时，它们也会保留到成年期以支持短寿命细胞的持续更换和受损后子细胞的再产生［16-19］。因为MSCs是能够自我更新以及能够分化成不同组织（骨、软骨、肌肉、皮肤和结缔组织）的多功能细胞，所以在骨组织工程中占据了核心地位。这些功能为临床提供了治愈大量骨疾病的新疗法。近期有研究从细胞分子生物水平上描述了控制MSCs分化的机制。这些研究已经确认细胞外的生物化学刺激能调控MSCs的分化与活性［4,9,12,20-22］，这些生物化学刺激包括激素、细胞因子（如骨形态发生蛋白（BMPs）、β转化生长因子家族、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子-I（IGF-I）、成纤维细胞生长因子（FGFs）、IL-1受体拮抗蛋白（IRAP）、白细胞介素-4（IL-4）、血小板源性生长因子（PDGF））和生物力学刺激［15］。胞内信号分子［如LMP-1、细胞信号转导分子Smad 1、5和8、局部黏着斑激酶（FAK）、钙离子］也能通过激活转录因子调控基因表达，如Runx2、鼠短尾突变体表型Brachyury或者硫氧化物Sox-9，这些信号调控分子能针对性地促进MSCs分化［23-25］。有实验显示电刺激可以调控钙振荡从而促进包含MSCs在内的骨生成，扁平细胞和扩散细胞通过RhoA的活化作用和肌球蛋白张力的上调进行骨生成，然而圆形细胞则是通过抑制RhoA来变成脂肪细胞［26］。在转录水平上，转录因子Sox-9是软骨形成的必要物质，而Runx2则是成骨细胞分化和出现Wnt信号将软骨细胞转化为成骨细胞的必要因素［9］。因此，对这些细胞信号通路的研究将为设计模仿自然组织形成的骨修复治疗方法提供基础［20,23］。 1.2.4骨组织工程中的生物材料 尽管小规模骨折可以轻易自我修复，但大规模骨折（粉碎性骨折、骨质疏松和软骨质组织）难以依靠再生和重构自我修复［20］。这种情况通常需要通过手术向受损位置植入移植骨或人造材料［27］。据统计，仅在美国每年就有超过200万次手术需要骨替代品，并且这种需求还在持续上涨中。预计至2030年，首次全髋关节置换术将增长174%，首次全膝关节术置换将增长673%。类似统计并不包括骨科植入物使用寿命（10～15年）引起的维修，而这种维修的需求也在稳定增长中［20］。毫无疑问，临床需求的增加需要大量骨移植物，这将在全世界范围内带来巨大的社会经济影响。传统的骨修复手术包括自体移植术（取自患者髂骨）和同种异体移植（取自尸体上的骨骼）［28］。目前为止，自身移植因其稳定的结构和天然的成骨能力一直被认为是受损骨再建的黄金法则［29,30］。尽管自体移植和同种异体移植已相当成功，但它们也有着严重的局限，如供体骨组织的来源受限、无法预测的排异及感染等［2,28］。特别是临床上治疗大范围骨质缺损需要的自体移植物，大约有40%的患者无法获得［31］。所以，临床上迫切需要更可靠、更丰富的骨替代物以替换或修复受损骨骼。 1.2.5三代骨修复材料 过去几十年间，随着材料科学与技术的迅速发展，生物材料领域衍生出了一系列的骨修复、移植替代品。目前，仅在德国就有超过100种的骨治疗修复材料［30］。在20~21世纪，骨治疗修复材料经过长足的发展，经历了三代材料的更替［32,33］：**代生物惰性（bioinert）材料；第二代生物活性和生物可降解（bioactive and biodegradable）材料；第三代细胞及基因激活（cell-and gene-activating）材料（在分子水平上刺激特定的分子反应而产生的材料，一旦植入将刺激机体自身修复）。 表1.1简要介绍了这三代材料［20，26，32-35］。 表1.1三代骨修复生物材料 在20世纪六七十年代诞生的**代材料仅是为了得到一种毒性低的材料，在对人体毒性*小的情况下能匹配被替换组织的物理性质（如力学性质）即可［32］。1980年，在美国有200万～300万由惰性生物材料做成的假体被植入患者身体，可延续患者5～25年的生命，提高生存质量［32,36］。在20世纪90年代中叶,第二代生物活性材料，包括羟基磷灰石微粒（hydroxyapatite particles）在内的生物活性复合材料开始在骨修复与骨替代中发挥重要作用［34-36］。尽管上述**、二代骨材料替代品已经在临床上成功应用于受损骨的修复与替代，但二者无法对生理或生物化学刺激产生响应，从某种程度上局限了它们的应用。对于大部分**、二代生物材料来说，主骨与植入骨间的不协调会导致应力遮挡效应，植入物的表面性能抑制新组织的再生进而引起植入物与主骨间结合的松散，这已经成为骨科植入失败的主要原因。因此，需要新办法来进一步改善骨组织的修复与再生。 *近10年中，第三代细胞及基因激活材料（也称为骨组织工程材料）已被制成细胞外基质支架，使骨祖细胞能在体外基质支架上增殖分化，在植入患者身体前更好地模仿活体中周围组织情况［34］。骨组织工程能通过诱导骨细胞黏着和增殖来刺激活体内新骨组织的再生，由此产生了比传统方法更有效的方式并且在治疗骨质缺损方面已经获得认可［34,28］。迄今为止，骨组织工程中*先进的一种方法是向患者体内移植细胞与材料结合的杂交复合物，杂交复合细胞、3D多孔支架和生物活性因子以形成完整的骨移植替代物。这种杂交复合结构物正是典型的第三代细胞及基因激活的材料（图1.3）［2,28,37,38］。用微创手术向病变或受伤位置植入细胞-生物支架材料杂化结构物后，从分子水平上刺激细胞的特定响应，激活特定基因表达以调控骨再生，逐渐形成新组织逐步代替缺失的骨骼［38-40］。基于此，新型骨修复疗法可以简短定义为“诱导机体固有的修复机能来自我修复”［12,39］。 图1.3骨组织工程简单示意图总体说来，新一代骨修复方法使用的生物材料，要求具备可分解、无毒、可再吸收并且有合适的力学、表面结构等物理特性。骨髓中的MSCs与转录因子和生长因子一同被移植到三维多孔支架材料上，细胞持续分化生长为杂交细胞-支架结构。成熟后，杂交细胞-支架结构移植入患者受伤部位。 1.2.6骨组织工程中的间充质干细胞骨组织工程和再生通常涉及分离及体外培养MSCs和随后向受损位置的移植。通常，MSCs从患者自身（包括骨髓基质、肌肉、皮肤、脂肪和牙龈）获得，这样避免了免疫并发症的发生。人们已经能从骨髓中分离得到MSCs，将之应用到骨、软骨和韧带的修复中［23,41-43］。1991年,Caplan**次提出“自体同源干细胞的分离、有丝分裂扩张和定向位点递送可控制骨组织的快速特定修复”