商品详情
书名：RNA纳米技术与治疗——方法与方案
定价：98.0
ISBN：9787030507631
作者：（美）郭培宣等著；汪琛颖，李闰婷译
版次：1
出版时间：2016-12
在线试读：
第1章 RNA纳米技术方法综述——RNA纳米颗粒的合成、纯化及特性
Farzin Haque 和 Peixuan Guo
摘 要 RNA纳米技术包括使用限定大小、结构和化学量的RNA作为一种结构材料，以自下而上的自组装方式来建立同性质的纳米结构。这个于1998年提出的开创性概念（Guo et al., Molecular Cell, 1998, 2:149–155; Molecular Cell是 Cell 的特色刊物）已经成为一个涉及材料工程和合成结构生物学的新领域（Guo, Nature Nanotechnology, 2010, 5:833–842）。人们对RNA纳米技术领域的关注度近几年急剧升高，在著名的期刊上发表的有关RNA纳米结构及其在纳米药物和纳米技术应用方面的文章激增。RNA化学、RNA生物物理学、RNA生物学的快速发展为基础科学向临床实践的转化创造了新的机遇。RNA纳米技术在这方面拥有相当大的发展前景。大量增加的证据显示，占人类基因组98.5%（Lander et al., Nature 409:860–926, 2001）、曾经的“垃圾DNA”，实际上是编码非编码RNA的。随着我们对RNA结构与功能相关性了解的日益增加，我们可以人工合成用于诊断和治疗疾病的RNA纳米颗粒。本章简要概述了在纳米技术和纳米医学方面有着不同应用的RNA纳米颗粒的设计、构建、纯化，以及它们的特性。
关键词 RNA纳米技术，纳米医学，纳米生物技术，RNA治疗，RNA纳米颗粒，pRNA，细菌噬菌体phi29，超速离心法，PAGE，HPLC，AFM
1 RNA纳米技术的定义
RNA因其在结构和功能上的多样性，已经成为一种独特的纳米材料。RNA具有较高的热力学稳定性[1，2]，表现出规则和不规则的碱基配对性能[3～7]，以及碱基堆积能力和三级结构互作能力[1，2]。通过转录、终止、自我加工、剪接，RNA在体内自我组装[8～14]产生RNA片段。RNA还表现出一些特殊的功能，如siRNA、miRNA、RNA适配子、核糖开关和核酶。RNA纳米技术是一个独特的领域[14～17]，有别于经典的RNA结构/折叠的研究及RNA的分子生物学研究[18～24]。除了分子内（在一个分子内）相互作用和折叠之外，还需要分子间（不同分子之间）的相互作用。RNA纳米颗粒可通过纯化达到均质化，并且可通过化学、物理、生物物理学和光学方法来定性。简单地结合功能性RNA组件到金、脂质体、树枝状大分子或聚合物纳米颗粒并不等同于RNA纳米技术；相反，RNA纳米技术是以自下而上的途径来组装由RNA作为主要成分的纳米级粒子的。
纳米技术平台与其他纳米传送系统（如脂质、聚合物、树枝状聚合物、无机物、病毒等）相比很独特，主要表现在以下几个方面：①某些RNA纳米颗粒，比如包装RNA-3叉接口（pRNA-3WJ）结构，热力学性质稳定，耐8 mol/L尿素变性，体内超低浓度不解离[25，26]；通过2′-氟（2′-F）化学修饰获得核糖核酸酶抗性，同时保持原初的折叠，以及支架和结合功能组件真正的生物活性[25～27]；②RNA是一种阴离子聚合物，因此能够避免通过带负电荷的细胞膜进入非特异性细胞，以及在此过程减少由于通过肝脏枯否细胞和肺巨噬细胞[15，32]滞留引起的脏器蓄积的毒性效应；③RNA纳米颗粒有限定的大小、结构和化学量，因此，可以避免由非匀质粒子产生的不可预知的副作用[25，26，33，34]，一些RNA纳米颗粒还有促进穿透肿瘤和EPR（增强渗透与滞留）效应的有利形状[25，34]；④典型的RNA纳米颗粒直径为10～100nm，这足以纳入化疗药物、siRNA、miRNA和/或RNA适配子，它们的大小足以避免通过肾脏排泄，同时又可以通过受体介导的内吞作用进入靶细胞[35]；⑤RNA纳米颗粒是高度可溶的，不易产生聚集，不需要连接聚乙二醇或血清白蛋白[15，36]，通常作为广泛使用的普通纳米颗粒；⑥RNA纳米颗粒的多价性允许一个模块化的设计，这项技术的真正独特之处在于它能够设计不同功能的RNA片段序列，而且可以自组装成完整的超微粒[25，26，34]；⑦在体内，pRNA-3WJ纳米颗粒展示出良好的药代动力学和生物分布轮廓，无毒，在小鼠体内不诱导I型干扰素或产生细胞因子[25，26，34，36]；⑧给小鼠全身注射pRNA-3WJ纳米颗粒3～4h后可强烈地结合肿瘤，几乎不或完全不在健康的肝脏、肺、脾脏和肾脏中累积[25，26，34，36]；⑨RNA纳米颗粒不含蛋白质，不引起宿主抗体反应，这将允许重复治疗癌症和慢性疾病，特别适用于那些对蛋白试剂起中和抗体反应的患者。
在本章，我们主要简述了RNA纳米技术领域中关于RNA纳米颗粒的设计、构建、纯化及其特性。有兴趣的读者如果想进行更深入的分析，可以阅读参考文献中提到的几本优秀的综述，以及多年来已出版的相关书籍[15～17，37～42]。
2 构建多功能RNA纳米颗粒
构建RNA纳米颗粒包括7个步骤（图1-1）[15]。第*步是构思，需要定义希望得到的纳米颗粒的特性，如整体结构、形状和潜在的应用（见第4、7、9～11、13和14章）。第二步涉及一种计算方法来预测各个建筑块的结构/折叠及组装在*终的RNA复合体中RNA分子间和分子内的相互作用（第2、4和13章）。有几个可用于预测RNA折叠的在线资源，如Mfold[43]、RNA designer[44]、Sfold[45]、NUPACK [46]和其他[47]。第三步是单体建筑块的合成，无论是使用T7 RNA聚合酶在体外转录（第2、4～11章），或是使用亚磷酰胺化学过程的化学合成（第9和10章）。第四步是既可以通过模板化（面对空间、结构或外力），又可以通过非模板化（无任何约束）的方法组装RNA四级结构架构（第4、7、9、10和13章）。第五步是纯化单个RNA片段及整个组装的RNA纳米颗粒（第2、5～7、9和10章）。第六步是利用各种不同的生物化学、生物物理学和生物信息学方法，如原子力显微镜（AFM）、电子显微镜（EM）、凝胶电泳和色谱法、热变性、超速离心等方法（第2、3、7、9、10、12～16章）对组装的RNA的特性进行深入描述。第七步，也是*后一步，是用于纳米药物和纳米技术的多功能RNA 纳米构造的应用（第7、9～13章）。
图1-1 RNA纳米技术的方法。构建RNA纳米颗粒包括7个关键步骤：构思、计算、合成、组装、纯化、表征、应用。图来源于参考文献[15]并经过调整和修改，Nature Publishing Group众所周知，RNA容易受到影响而在血清中降解。为了提高RNA的化学稳定性，可以对碱基（如形成5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶）[48]、磷酸键（如形成硫代磷酸酯和boranophosphate）、核糖2'-羟基（如形成2'-氟、2'-O-甲基或2'-NH2）[27，50～52]进行修饰。2'-氟（2'-F）修饰是体内比较常用的修饰方式，可导致RNA纳米颗粒在大多数的情况下表现出其真实的结构和生物学功能[25，27]（第9和10章）。这不仅提高了其化学稳定性，而且增加了熔化温度[53]。
2.1 纳米颗粒的RNA支架组装
天然的RNA分子中含有环、螺旋、凸起、茎、结和假结，所有这些结构基元可以作为组装精确控制形状、结构和化学量的RNA三维结构的建筑砌块[15]。噬菌体phi29 DNA包装马达是包装RNA（pRNA）的一个典型例子[54]。郭培宣博士于1998年的开拓性工作表明，可以由再造RNA片段的pRNA合成二聚体、三聚体和六聚体RNA结构[14]。pRNA多功能子，其所具有的三种结构特征可用于构建多效价RNA纳米颗粒。①环–环（手拉手）相互作用：pRNA包含两个连锁环（表示右手环和左手环），可以通过环-环相互作用被设计形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体纳米结构[14][图1-2（a）]。②回文序列（脚-脚相互作用）：回文序列从5'→3'方向的一股链和互补链的5'→3'方向读取的是相同的序列，在pRNA螺旋端引入回文序列可以高效促进桥接RNA结构的自组装（脚对脚的分子间相互作用）[33，34][图1-2（a）]。③使用连接结构基元形成分支RNA：pRNA的中央部分包含一个3WJ（三叉连接）结构基元，它是由3个短RNA片段以异常高的效率组装而成[25，26]。pRNA-3WJ具有高度可编程性[55]，可用于形成高度分支的结构，以及带有目标几何形状的多聚体结构[25，26，34，56～58]（见第7、9和10章中有代表性的实例pRNA-3WJ，拥有多功能模块结构基元）（图1-2和图1-3）。
RNA通过规则和不规则的碱基配对、碱基堆积和三级结构相互作用，自然地折叠成复杂的结构，因此，管理RNA折叠的规则非常复杂。Bruce Shapiro研究团队已经开发了各种计算方法（建模软件，如RNA2D3D[59]、Nanotiller[60]）和分子动力学模拟（molecular dynamics simulation）来设计RNA序列（模块化积木）装置以自组装成设计的三维结构，如纳米颗粒和纳米环[61，62]。他们还开发了数据库[11]以提取已知的RNA结构单位来制备具有期望性能的新型RNA纳米颗粒。这些纳米支架可以进一步被功能化，具备治疗模块和荧光素，如银纳米簇是用来跟踪。
图1-2 利用pRNA建筑砌块的结构特点构建各种形状和大小的多价RNA纳米颗粒支架。
（a）RNA多聚体：由环–环（手拉手）互作形成六聚体（左）；通过脚对脚相互作用，使用回文序列（中心）和分支扩展，利用pRNA-3WJ结构基元作为中心支架（右）。（b）RNA多边形:在每个多边形的角上调整pRNA-3WJ结构基元可形成三角形、正方形、五边形。（c）RNA正方形：RNA正方形的大小可以通过改变框架序列中连接核苷酸的数目来调整。（d）使用RNA三角在RNA多聚体中作为角单元形成RNA蜂巢形格式的六聚体。（e）使用六聚体单元在（d）中作为重复单位形成结构化RNA阵列结构。（f）使用联合的pRNA二聚体（环–环相互作用）和双生（脚对脚相互作用）形成RNA束。经允许，图复制于：（a）参考文献[34]，冷泉港实验室出版社；（b）参考文献[57]牛津大学出版社；（c）参考文献[58]美国化学学会；（d，e）参考文献[56]美国化学学会；（f）参考文献[33]美国化学学会
图1-3 构建具有功能模块的RNA纳米颗粒。
（a）具有RNA适配体（Spinalh和MG）、乙型肝炎病毒核酶和siRNA的RNA正方形示意图（左）、凝胶图（中央）和原子力显微镜图（右）；（b）具有CpG基序的RNA纳米颗粒的免疫刺激作用（RNA三角形、正方形和五边形）。经允许，图复制于：（a）参考文献[58]美国化学学会；（b）参考文献[57]牛津大学出版社RNA纳米颗粒的逐步组装的（见第4章）。
Veronique Arluison研究小组描述了如何调控非编码小分子RNA（sRNA）在细菌作为支架通过自组装构建多聚体结构（见第2章）。这些sRNA往往含有茎环序列，可以调节体内分子内和分子间的相互作用以形成多聚体复合物，如在大肠杆菌中观察到的DsrA及GcvB sRNA。作者使用了几种可用的RNA结构预测软件，如Mfold[43]和UNAFold[63]，可检验sRNA复合物的二级结构。
定价：98.0
ISBN：9787030507631
作者：（美）郭培宣等著；汪琛颖，李闰婷译
版次：1
出版时间：2016-12
在线试读：
第1章 RNA纳米技术方法综述——RNA纳米颗粒的合成、纯化及特性
Farzin Haque 和 Peixuan Guo
摘 要 RNA纳米技术包括使用限定大小、结构和化学量的RNA作为一种结构材料，以自下而上的自组装方式来建立同性质的纳米结构。这个于1998年提出的开创性概念（Guo et al., Molecular Cell, 1998, 2:149–155; Molecular Cell是 Cell 的特色刊物）已经成为一个涉及材料工程和合成结构生物学的新领域（Guo, Nature Nanotechnology, 2010, 5:833–842）。人们对RNA纳米技术领域的关注度近几年急剧升高，在著名的期刊上发表的有关RNA纳米结构及其在纳米药物和纳米技术应用方面的文章激增。RNA化学、RNA生物物理学、RNA生物学的快速发展为基础科学向临床实践的转化创造了新的机遇。RNA纳米技术在这方面拥有相当大的发展前景。大量增加的证据显示，占人类基因组98.5%（Lander et al., Nature 409:860–926, 2001）、曾经的“垃圾DNA”，实际上是编码非编码RNA的。随着我们对RNA结构与功能相关性了解的日益增加，我们可以人工合成用于诊断和治疗疾病的RNA纳米颗粒。本章简要概述了在纳米技术和纳米医学方面有着不同应用的RNA纳米颗粒的设计、构建、纯化，以及它们的特性。
关键词 RNA纳米技术，纳米医学，纳米生物技术，RNA治疗，RNA纳米颗粒，pRNA，细菌噬菌体phi29，超速离心法，PAGE，HPLC，AFM
1 RNA纳米技术的定义
RNA因其在结构和功能上的多样性，已经成为一种独特的纳米材料。RNA具有较高的热力学稳定性[1，2]，表现出规则和不规则的碱基配对性能[3～7]，以及碱基堆积能力和三级结构互作能力[1，2]。通过转录、终止、自我加工、剪接，RNA在体内自我组装[8～14]产生RNA片段。RNA还表现出一些特殊的功能，如siRNA、miRNA、RNA适配子、核糖开关和核酶。RNA纳米技术是一个独特的领域[14～17]，有别于经典的RNA结构/折叠的研究及RNA的分子生物学研究[18～24]。除了分子内（在一个分子内）相互作用和折叠之外，还需要分子间（不同分子之间）的相互作用。RNA纳米颗粒可通过纯化达到均质化，并且可通过化学、物理、生物物理学和光学方法来定性。简单地结合功能性RNA组件到金、脂质体、树枝状大分子或聚合物纳米颗粒并不等同于RNA纳米技术；相反，RNA纳米技术是以自下而上的途径来组装由RNA作为主要成分的纳米级粒子的。
纳米技术平台与其他纳米传送系统（如脂质、聚合物、树枝状聚合物、无机物、病毒等）相比很独特，主要表现在以下几个方面：①某些RNA纳米颗粒，比如包装RNA-3叉接口（pRNA-3WJ）结构，热力学性质稳定，耐8 mol/L尿素变性，体内超低浓度不解离[25，26]；通过2′-氟（2′-F）化学修饰获得核糖核酸酶抗性，同时保持原初的折叠，以及支架和结合功能组件真正的生物活性[25～27]；②RNA是一种阴离子聚合物，因此能够避免通过带负电荷的细胞膜进入非特异性细胞，以及在此过程减少由于通过肝脏枯否细胞和肺巨噬细胞[15，32]滞留引起的脏器蓄积的毒性效应；③RNA纳米颗粒有限定的大小、结构和化学量，因此，可以避免由非匀质粒子产生的不可预知的副作用[25，26，33，34]，一些RNA纳米颗粒还有促进穿透肿瘤和EPR（增强渗透与滞留）效应的有利形状[25，34]；④典型的RNA纳米颗粒直径为10～100nm，这足以纳入化疗药物、siRNA、miRNA和/或RNA适配子，它们的大小足以避免通过肾脏排泄，同时又可以通过受体介导的内吞作用进入靶细胞[35]；⑤RNA纳米颗粒是高度可溶的，不易产生聚集，不需要连接聚乙二醇或血清白蛋白[15，36]，通常作为广泛使用的普通纳米颗粒；⑥RNA纳米颗粒的多价性允许一个模块化的设计，这项技术的真正独特之处在于它能够设计不同功能的RNA片段序列，而且可以自组装成完整的超微粒[25，26，34]；⑦在体内，pRNA-3WJ纳米颗粒展示出良好的药代动力学和生物分布轮廓，无毒，在小鼠体内不诱导I型干扰素或产生细胞因子[25，26，34，36]；⑧给小鼠全身注射pRNA-3WJ纳米颗粒3～4h后可强烈地结合肿瘤，几乎不或完全不在健康的肝脏、肺、脾脏和肾脏中累积[25，26，34，36]；⑨RNA纳米颗粒不含蛋白质，不引起宿主抗体反应，这将允许重复治疗癌症和慢性疾病，特别适用于那些对蛋白试剂起中和抗体反应的患者。
在本章，我们主要简述了RNA纳米技术领域中关于RNA纳米颗粒的设计、构建、纯化及其特性。有兴趣的读者如果想进行更深入的分析，可以阅读参考文献中提到的几本优秀的综述，以及多年来已出版的相关书籍[15～17，37～42]。
2 构建多功能RNA纳米颗粒
构建RNA纳米颗粒包括7个步骤（图1-1）[15]。第*步是构思，需要定义希望得到的纳米颗粒的特性，如整体结构、形状和潜在的应用（见第4、7、9～11、13和14章）。第二步涉及一种计算方法来预测各个建筑块的结构/折叠及组装在*终的RNA复合体中RNA分子间和分子内的相互作用（第2、4和13章）。有几个可用于预测RNA折叠的在线资源，如Mfold[43]、RNA designer[44]、Sfold[45]、NUPACK [46]和其他[47]。第三步是单体建筑块的合成，无论是使用T7 RNA聚合酶在体外转录（第2、4～11章），或是使用亚磷酰胺化学过程的化学合成（第9和10章）。第四步是既可以通过模板化（面对空间、结构或外力），又可以通过非模板化（无任何约束）的方法组装RNA四级结构架构（第4、7、9、10和13章）。第五步是纯化单个RNA片段及整个组装的RNA纳米颗粒（第2、5～7、9和10章）。第六步是利用各种不同的生物化学、生物物理学和生物信息学方法，如原子力显微镜（AFM）、电子显微镜（EM）、凝胶电泳和色谱法、热变性、超速离心等方法（第2、3、7、9、10、12～16章）对组装的RNA的特性进行深入描述。第七步，也是*后一步，是用于纳米药物和纳米技术的多功能RNA 纳米构造的应用（第7、9～13章）。
图1-1 RNA纳米技术的方法。构建RNA纳米颗粒包括7个关键步骤：构思、计算、合成、组装、纯化、表征、应用。图来源于参考文献[15]并经过调整和修改，Nature Publishing Group众所周知，RNA容易受到影响而在血清中降解。为了提高RNA的化学稳定性，可以对碱基（如形成5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶）[48]、磷酸键（如形成硫代磷酸酯和boranophosphate）、核糖2'-羟基（如形成2'-氟、2'-O-甲基或2'-NH2）[27，50～52]进行修饰。2'-氟（2'-F）修饰是体内比较常用的修饰方式，可导致RNA纳米颗粒在大多数的情况下表现出其真实的结构和生物学功能[25，27]（第9和10章）。这不仅提高了其化学稳定性，而且增加了熔化温度[53]。
2.1 纳米颗粒的RNA支架组装
天然的RNA分子中含有环、螺旋、凸起、茎、结和假结，所有这些结构基元可以作为组装精确控制形状、结构和化学量的RNA三维结构的建筑砌块[15]。噬菌体phi29 DNA包装马达是包装RNA（pRNA）的一个典型例子[54]。郭培宣博士于1998年的开拓性工作表明，可以由再造RNA片段的pRNA合成二聚体、三聚体和六聚体RNA结构[14]。pRNA多功能子，其所具有的三种结构特征可用于构建多效价RNA纳米颗粒。①环–环（手拉手）相互作用：pRNA包含两个连锁环（表示右手环和左手环），可以通过环-环相互作用被设计形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体纳米结构[14][图1-2（a）]。②回文序列（脚-脚相互作用）：回文序列从5'→3'方向的一股链和互补链的5'→3'方向读取的是相同的序列，在pRNA螺旋端引入回文序列可以高效促进桥接RNA结构的自组装（脚对脚的分子间相互作用）[33，34][图1-2（a）]。③使用连接结构基元形成分支RNA：pRNA的中央部分包含一个3WJ（三叉连接）结构基元，它是由3个短RNA片段以异常高的效率组装而成[25，26]。pRNA-3WJ具有高度可编程性[55]，可用于形成高度分支的结构，以及带有目标几何形状的多聚体结构[25，26，34，56～58]（见第7、9和10章中有代表性的实例pRNA-3WJ，拥有多功能模块结构基元）（图1-2和图1-3）。
RNA通过规则和不规则的碱基配对、碱基堆积和三级结构相互作用，自然地折叠成复杂的结构，因此，管理RNA折叠的规则非常复杂。Bruce Shapiro研究团队已经开发了各种计算方法（建模软件，如RNA2D3D[59]、Nanotiller[60]）和分子动力学模拟（molecular dynamics simulation）来设计RNA序列（模块化积木）装置以自组装成设计的三维结构，如纳米颗粒和纳米环[61，62]。他们还开发了数据库[11]以提取已知的RNA结构单位来制备具有期望性能的新型RNA纳米颗粒。这些纳米支架可以进一步被功能化，具备治疗模块和荧光素，如银纳米簇是用来跟踪。
图1-2 利用pRNA建筑砌块的结构特点构建各种形状和大小的多价RNA纳米颗粒支架。
（a）RNA多聚体：由环–环（手拉手）互作形成六聚体（左）；通过脚对脚相互作用，使用回文序列（中心）和分支扩展，利用pRNA-3WJ结构基元作为中心支架（右）。（b）RNA多边形:在每个多边形的角上调整pRNA-3WJ结构基元可形成三角形、正方形、五边形。（c）RNA正方形：RNA正方形的大小可以通过改变框架序列中连接核苷酸的数目来调整。（d）使用RNA三角在RNA多聚体中作为角单元形成RNA蜂巢形格式的六聚体。（e）使用六聚体单元在（d）中作为重复单位形成结构化RNA阵列结构。（f）使用联合的pRNA二聚体（环–环相互作用）和双生（脚对脚相互作用）形成RNA束。经允许，图复制于：（a）参考文献[34]，冷泉港实验室出版社；（b）参考文献[57]牛津大学出版社；（c）参考文献[58]美国化学学会；（d，e）参考文献[56]美国化学学会；（f）参考文献[33]美国化学学会
图1-3 构建具有功能模块的RNA纳米颗粒。
（a）具有RNA适配体（Spinalh和MG）、乙型肝炎病毒核酶和siRNA的RNA正方形示意图（左）、凝胶图（中央）和原子力显微镜图（右）；（b）具有CpG基序的RNA纳米颗粒的免疫刺激作用（RNA三角形、正方形和五边形）。经允许，图复制于：（a）参考文献[58]美国化学学会；（b）参考文献[57]牛津大学出版社RNA纳米颗粒的逐步组装的（见第4章）。
Veronique Arluison研究小组描述了如何调控非编码小分子RNA（sRNA）在细菌作为支架通过自组装构建多聚体结构（见第2章）。这些sRNA往往含有茎环序列，可以调节体内分子内和分子间的相互作用以形成多聚体复合物，如在大肠杆菌中观察到的DsrA及GcvB sRNA。作者使用了几种可用的RNA结构预测软件，如Mfold[43]和UNAFold[63]，可检验sRNA复合物的二级结构。