书名：实时荧光PCR技术（第2版）  
定价：118.0  
ISBN：9787030498274  
作者：李金明  
版次：1  
出版时间：2016-10  

内容提要：  
本书系统阐述了实时荧光PCR技术的基础理论和临床检测方法，共25章。包括实时荧光PCR技术的基本原理和方法，PCR实验室设计与质量管理，检验标本的采集、运送、保存及核酸提取，PCR测定数据处理，PCR检验仪器设备，检验质量保证，病毒核酸检测的标准物质，以及各型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、巨细胞病毒、冠状病毒、EB病毒、流感病毒、沙眼衣原体、结核杆菌、淋病奈瑟菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体、刚地弓形虫、解脲支原体等实时荧光PCR检测的标本采集与处理、引物和探针设计及临床意义。本书资料翔实、新颖，实用性、指导性强，是从事临床疫病研究、诊治的重要参考书。  

目录：  
目录  
第1章 临床PCR技术的发展历史及趋势(1)  
第*节PCR的起源和耐热DNA聚合酶的应用(1)  
一、PCR的起源(1)  
二、耐热DNA聚合酶的应用(2)  
第二节PCR的基本原理(3)  
第三节PCR的反应动力学(5)  
第四节PCR的扩增体系和扩增条件(5)  
一、PCR扩增体系的基本要素(5)  
二、PCR的标准扩增体系(8)  
三、PCR扩增的增强剂(9)  
四、降落PCR(9)  
五、热启动PCR(10)  
六、COLDGPCR(10)  
七、PCR扩增结果分析(11)  
第五节PCR的特点(12)  
一、高特异性(12)  
二、高灵敏度(12)  
三、简便快速(12)  
四、特定的低纯度标本也可使用(12)  
第六节PCR的发展(12)  
参考文献(13)  
第2章 实时荧光PCR技术的基本原理和方法(14)  
第*节发展历程(14)  
第二节基本原理(15)  
一、PCR扩增的理论模式(15)  
二、实时荧光PCR的理论基础(16)  
三、TaqMan实时荧光PCR的基本原理(17)  
四、双链DNA交联荧光染料实时荧光PCR的基本原理(19)  
五、双杂交探针实时荧光PCR的基本原理(20)  
六、分子信标实时荧光PCR的基本原理(20)  
七、蝎形探针实时荧光PCR的基本原理(21)  
八、数字实时荧光PCR的基本原理(24)  
第三节引物、探针的特点及设计软件(26)  
一、引物的特点(26)  
二、探针的特点(26)  
三、引物和探针设计软件(27)  
第四节多重实时荧光PCR(28)  
参考文献(28)  
第3章 临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立(30)  
第*节实验室的分区规划设计(30)  
一、标本的接收(30)  
二、实验室分区设计的一般原则及工作流程(31)  
第二节实验室质量管理体系的建立(39)  
一、实验室质量管理概述(39)  
二、实验室质量管理的特点(41)  
三、质量体系文件的编写(42)  
第三节实验室的记录管理(56)  
一、记录的种类(56)  
二、记录的标识(56)  
三、记录的填写(57)  
四、记录的封面和目录(59)  
五、记录的良好保存(59)  
六、记录的保存期限(59)  
七、过期记录的处理(59)  
八、记录表格样式的持续改进(59)  
九、电子记录的管理(60)  
第四节实验室验收与实验室认可(60)  
一、实验室认可的由来及目的(60)  
二、实验室认可与认证的区别(61)  
三、实验室验收与实验室认可的关系(61)  
参考文献(62)  
第4章 临床PCR检验标本的采集、运送、保存及核酸提取(63)  
第*节标本采集、运送、保存(63)  
一、标本采集(63)  
二、标本运送(65)  
三、标本保存(65)  
第二节常见临床标本的处理和保存(66)  
一、血清(浆)样本(66)  
二、全血样本(66)  
三、外周血单个核细胞(66)  
四、痰(66)  
五、棉拭子(67)  
六、脓液(67)  
七、体液(68)  
八、乳汁(68)  
九、组织(69)  
第三节临床标本中PCR抑制物(70)  
一、临床标本中PCR抑制物的来源及作用机制(70)  
二、几种常见抑制物的作用机制及对策(70)  
第四节核酸的提取方法(72)  
一、DNA提取的经典方法(72)  
二、RNA的提取(73)  
三、核酸提取的改良方法(74)  
参考文献(78)  
第5章 实时荧光PCR测定的数据处理(83)  
第*节基本概念(83)  
第二节实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型(85)  
一、基本计算公式的推导(85)  
二、纵坐标为起始拷贝数对数值横坐标为Ct时的数学模型(85)  
三、纵坐标为Ct横坐标为起始拷贝数时的数学模型(86)  
第三节实时荧光PCR相对定量的数学模型(87)  
一、相对定量的标准曲线法(87)  
二、2-ΔΔCt法(89)  
三、2-ΔΔCt的改良方法(89)  
四、多重PCR法(91)  
第四节用曲线拟合的方法进行数据处理(92)  
一、Liu与Saint的方法(92)  
二、Ramakers等的方法(92)  
三、Tichopad等的方法(92)  
参考文献(93)  
第6章 实时荧光PCR仪及其发展(94)  
第*节PCR仪的发展历史及基本原理(94)  
一、空气驱动循环PCR仪(94)  
二、变温金属块PCR仪(95)  
第二节实时荧光PCR仪简介(95)  
一、美国ABI公司生产的实时荧光PCR仪(95)  
二、美国Cepheid公司的SmartCycler实时荧光PCR仪(98)  
三、美国BioGRad公司的实时荧光PCR仪(99)  
四、美国Stratagene公司的实时荧光PCR仪(100)  
五、Roche公司的LightCycler实时荧光PCR仪(101)  
六、Corbert的RotorGene实时荧光PCR仪(103)  
七、Eppendorf公司的Mastercyclereprealplex实时荧光PCR仪(104)  
第三节实时荧光PCR仪选择(104)  
一、仪器使用的广泛程度(104)  
二、工作量(104)  
三、耗材的开放性(105)  
四、硬件设计特点(105)  
五、检测通道和可检测的荧光染料(105)  
六、温度梯度功能(105)  
七、软件功能(105)  
第四节数字PCR仪简介(106)  
一、微流控芯片数字PCR(107)  
二、液滴数字PCR(107)  
第五节实时荧光PCR仪的使用、维护和校准(108)  
一、实时荧光PCR仪使用中的注意事项(108)  
二、维护和校准(108)  
参考文献(111)  
第7章 临床PCR检验仪器设备的使用、维护和校准(112)  
第*节天平(112)  
一、电子分析天平及其分类(112)  
二、天平的正确使用(113)  
三、天平的选择(114)  
四、天平的维护和校准(114)  
第二节离心机(115)  
一、离心机离心的基本原理(115)  
二、离心力和相对离心力(116)  
三、离心时间(116)  
四、离心转子的选择(119)  
五、离心管(119)  
六、离心机的分类(119)  
七、离心机的使用和维护(120)  
第三节微量加样器(122)  
一、微量加样器的一般原理及分类(122)  
二、加样器的选择及使用(123)  
三、加样器的维护和校准(129)  
参考文献(133)  
第8章 临床PCR检验的质量保证(134)  
第*节概述(134)  
一、基本概念(134)  
二、质量保证、室内质量控制和室间质量评价之间的关系(136)  
三、标本采集、运送、保存及其质量控制(136)  
第二节室内质量控制(137)  
一、测定前质量控制(137)  
二、核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制(144)  
三、统计学质量控制(146)  
第三节室间质量评价(160)  
一、室间质量评价的程序设计(161)  
二、室间质量评价的局限性(164)  
参考文献(165)  
第9章 病毒核酸检测的标准物质及其应用(167)  
第*节概述(167)  
一、基本概念(167)  
二、病毒核酸检测用标准物质的种类和溯源关系(169)  
第二节病毒核酸检测用标准物质的制备(170)  
一、原材料的选择和分装(171)  
二、均匀性和稳定性(172)  
三、定值(174)  
四、标准物质的保存(175)  
五、核酸检测用标准物质的意义(175)  
六、核酸检测用标准物质的展望(176)  
参考文献(179)  
第10章 甲型肝炎病毒实时荧光PCR检测及临床意义(182)  
一、HAV的特点(182)  
二、HAVRNA实时荧光RTGPCR检测(182)  
三、HAVRNA检测的临床意义(185)  
参考文献(186)  
第11章 乙型肝炎病毒实时荧光PCR检测及临床意义(187)  
一、HBV的特点(187)  
二、HBVDNA实时荧光PCR测定(190)  
三、HBV变异的检测及其临床意义(196)  
四、HBVcccDNA的检测及其临床意义(200)  
五、HBV基因型的检测及其临床意义(201)  
六、HBVRNA的检测及其临床意义(204)  
七、HBV全基因组测定及其临床意义(205)  
参考文献(206)  
第12章 丙型肝炎病毒实时荧光RTGPCR检测及临床意义(210)  
一、HCV的形态和基因组结构特点(210)  
二、HCV的复制特点(211)  
三、HCV的变异特点及基因型(211)  
四、HCVRNA实时荧光RTGPCR测定(212)  
五、HCV基因分型检测及其临床意义(220)  
参考文献(223)  
第13章 人免疫缺陷病毒G1实时荧光RTGPCR检测及临床意义(226)  
一、HIVG1的特点(226)  
二、HIVG1RNA的实时荧光RTGPCR测定(227)  
三、HIVG1RNA测定的临床意义(234)  
参考文献(235)  
第14章 人乳头瘤病毒实时荧光PCR检测及临床意义(237)  
一、HPV的形态和基因结构特点(237)  
二、HPV的体内复制特点(239)  
三、病毒的变异特点(239)  
四、HPV基因型(240)  
五、HPVDNA的实时荧光PCR测定(240)  
六、HPVDNA检测的临床意义(248)  
参考文献(250)  
第15章 巨细胞病毒实时荧光PCR检测及临床意义(253)  
一、人类巨细胞病毒的特点(253)  
二、人类巨细胞病毒实时荧光PCR测定(254)  
三、巨细胞病毒PCR检测的临床意义(267)  
参考文献(268)  
第16章 严重急性呼吸综合征冠状病毒实时荧光RTGPCR检测及临床意义(269)  
一、SARSGCoV的特点(269)  
二、SARSGCoVRNA实时荧光RTGPCR检测(270)  
三、SARSGCoVPCR检测的临床意义(286)  
参考文献(286)  
第17章 EB病毒实时荧光PCR检测及临床意义(288)  
一、EB病毒的特点(288)  
二、EB病毒实时荧光PCR测定(289)  
三、EB病毒PCR检测的临床意义(294)  
参考文献(295)  
第18章 流感病毒实时荧光RTGPCR检测及临床意义(296)  
一、流感病毒的特点(296)  
二、流感病毒的实时荧光RTGPCR测定(298)  
三、流感病毒RTGPCR检测的临床意义(320)  
参考文献(320)  
第19章 风疹病毒实时荧光RTGPCR检测及临床意义(321)  
一、风疹病毒的形态和基因组结构及功能特点(321)  
二、风疹病毒的复制特点(322)  
三、风疹病毒的变异特点及基因型(323)  
四、风疹病毒实时荧光RTGPCR测定及其临床意义(323)  
参考文献(330)  
第20章 麻疹病毒实时荧光RTGPCR检测及临床意义(332)  
一、麻疹病毒的形态和基因组结构及功能特点(332)  
二、麻疹病毒的复制特点(334)  
三、麻疹病毒的变异特点及基因型(335)  
四、麻疹病毒实时荧光RTGPCR测定及其临床意义(335)  
参考文献(339)  
第21章 手足口病病原体实时荧光RTGPCR检测及临床意义(341)  
一、手足口病病原体的形态和基因组结构特点(341)  
二、手足口病病原体复制特点(341)  
三、手足口病病原体实时荧光RTGPCR测定及其临床意义(342)  
四、手足口病病原体检测及其临床意义(349)  
参考文献(349)  
第22章 埃博拉病毒实时荧光定量RTGPCR检测及临床意义(351)  
一、EBOV的形态和基因组结构特点(351)  
二、EBOV的基因分型(352)  
三、EBOVRNA实时荧光RTGPCR测定及其临床意义(352)  
参考文献(360)  
第23章 中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光RTGPCR检测及临床意义(361)  
一、MERSGCoV的形态和基因组结构特点(361)  
二、MERSGCoV的感染过程(362)  
三、MERSGCoVRNA实时荧光RTGPCR测定及其临床意义(363)  
参考文献(379)  
第24章 沙眼衣原体实时荧光PCR检测及临床意义(381)  
一、沙眼衣原体的形态和基因组结构特点(381)  
二、沙眼衣原体的实时荧光PCR测定(381)  
三、沙眼衣原体PCR检测的临床意义(391)  
参考文献(391)  
第25章 结核杆菌实时荧光PCR检测及临床意义(394)  
一、结核杆菌的特点(394)  
二、结核杆菌实时荧光PCR检测(395)  
三、结核杆菌PCR检测的临床意义(405)  
参考文献(406)  
第26章 淋病奈瑟菌实时荧光PCR检测及临床意义(407)  
一、淋病奈瑟菌的特点(407)  
二、淋病奈瑟菌实时荧光PCR测定(408)  
三、淋病奈瑟菌PCR检测的临床意义(418)  
参考文献(419)  
第27章 幽门螺杆菌实时荧光PCR检测及临床意义(420)  
一、幽门螺杆菌的特点(420)  
二、幽门螺杆菌实时荧光PCR测定(421)  
三、幽门螺杆菌PCR检测的临床意义(430)  
参考文献(430)  
第28章 肺炎支原体实时荧光PCR检测及临床意义(432)  
一、肺炎支原体的结构特点(432)  
二、肺炎支原体的实时荧光PCR检测(432)  
三、肺炎支原体PCR检测的临床意义(437)  
参考文献(437)  
第29章 刚地弓形虫实时荧光PCR检测及临床意义(438)  
一、刚地弓形虫的特点(438)  
二、刚地弓形虫的实时荧光PCR检测(439)  
三、刚地弓形虫PCR检测的临床意义(444)  
参考文献(444)  
第30章 解脲支原体实时荧光PCR检测及临床意义(446)  
一、解脲支原体的特点(446)  
二、解脲支原体实时荧光PCR检测(446)  
三、解脲支原体PCR检测的临床意义(451)  
参考文献(452)  
第31章 EGFR基因实时荧光PCR检测及临床意义(453)  
一、EGFR基因特点及常见突变类型(453)  
二、相关靶向治疗药物(454)  
三、EGFR基因突变实时荧光PCR测定及其临床意义(455)  
参考文献(463)  
第32章 KRAS基因实时荧光PCR检测及临床意义(466)  
一、KRAS基因特点及常见突变类型(466)  
二、KRAS基因突变实时荧光PCR测定及其临床意义(466)  
参考文献(477)  
第33章 BRAF基因突变的实时荧光PCR检测及临床意义(479)  
一、BRAF的基因组结构特点(479)  
二、BRAF基因突变实时荧光PCR测定及其临床意义(480)  
参考文献(484)  
第34章 PIK3CA基因突变实时荧光PCR检测及临床意义(486)  
一、PIK3CA的基因结构特点(486)  
二、PIK3CA基因突变实时荧光PCR测定及其临床意义(487)  
参考文献(497)  


在线试读：  
第1章临床PCR技术的发展历史及趋势  
PCR是英文polymerasechainreaction的缩写,翻译过来,称为聚合酶链反应.zui早也有人将其翻译为多聚酶链反应,但现已统一起来.PCR自1983年发明至今,虽只短短的30多年,但其在生命科学研究中的作用以“支点”来形容却一点不为过.现在从事生命科学研究的人们一谈到PCR时,总喜欢用“革命”一词来形容,认为其对生命科学的研究来说,是一项革命性的技术,尽管发明人Mulis本人认为,PCR只是一个简单的不起眼玩意.事实却是,如果没有PCR,人类基因组计划不可能在如此短的时间得已初步完成,就是2003年的严重急性呼吸综合征(SARS)病原体的发现,也很难在那么短的时间内实现.涉及基因操作的几乎所有研究将比现在花费更多的时间和财力.那么,这项“革命”性的生物技术又是如何成为我们手中有力的基因研究工具的呢?也许,简单地回顾一下PCR的发明史,可以带给我们一些启示.  
第*节PCR的起源和耐热DNA聚合酶的应用  
一、PCR的起源  
应该说,zui早的关于核酸体外扩增的设想可以回溯到20世纪70年代初,发现DNA聚合酶的科学家Khorana及其同事于1971年提出:“经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因.但”由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物,且1970年Smith等发现了DNA限制性内切酶,使体外克隆和扩增基因成为可能,于是有了相应的手段,人们寻找更好、但在当时很难做到的方法的热情就少了许多,所以,Khorana等的早期设想被人们遗忘.  
PCR的出现可以说与DNA聚合酶的发现是分不开的.DNA聚合酶Ⅰzui早发现于1955年,但直到20世纪70年代Klenow等才发现较具有实验价值及易于得到的大肠埃希菌的Klenow片段.随着后来DNA限制性内切酶的发现,人们找到了一种可以按自己的意愿,克隆表达某一特定基因(如编码干扰素的基因)的办法,因此在20世纪70年代初以表达特定功能蛋白质为目标的基因工程技术在全世界风行开来,成立于70年代初的位于美国加利福尼亚的Cetus公司,就是这样一个生物技术公司.由于其在以基因工程技术进行生物药物开发中,需要大量的寡核苷酸探针,于是1972年毕业于加利福尼亚大学伯克利分校的Mulis博士于1979年应聘到该公司,担任寡核苷酸合成部门负责人.但到了80年代初,由于核酸合成仪的发明,寡核苷酸的人工合成逐步由机器所取代,此时,Mulis博士及其部门的工作则主要为核酸测序,即证明所合成的寡核苷酸或克隆的序列的正确性.当时所用的核酸测序方法为后来曾获得过诺贝尔奖的Sanger发明的双脱氧测序法,亦即Sanger法.这种方法是在将待测序单链DNA模板与合成的寡核苷酸引物退火后,分成四管反应,每管中的四种核苷酸合成原料dATP、dTTP、dCTP和dGTP中分别有一种为放射性核素标记的双脱氧核苷酸即ddATP,或ddTTP,或ddCTP,或ddGTP,在DNA聚合酶的存在下,引物延伸,如遇到相应的ddNTP(N代表A、T、C、G的任一种)结合上去,延伸反应即会立即终止,电泳后经放射自显影即可从应的ddNTP推测模板DNA的序列.Mulis博士是一个思维非常活跃的人,常有各种奇思妙想,尽管后来的事实证明绝大多数是不现实的.Mulis在应用双脱氧方法测序时,他就想能不能有一个更简单的方法,他想如果在反应体系中只是加入一种ddNTP,而不加入其他三种dNTP,如在引物3′端所对应的核苷酸正好是与所加入的ddNTP互补,则反应就会立即终止,可以减少反应时间.他又想如果再设计一条与DNA模板另一条链互补的引物,同时对DNA两条链进行测序,就可达到对测序结果相互验证的目的.但前一点很难做到,因为在核酸模板制备时,由于振荡混匀、离心等操作,在所制备的模板溶液中,常有脱落的游离dNTP存在.于是,Mulis想如果在加入ddNTP之前,先加入引物和聚合酶进行聚合延伸,将游离的dNTP消耗掉,不就可以了吗?但这时,他突然意识到,经过这样的一个聚合延伸后,原来的DNA不就增加了一倍了吗,如果再来一次,又会增加一倍,循环往复,而有一种指数增加过程.这就是PCRzui原始的“概念”.这种意识是其在1983年春天的一个周末驾车在加利福尼亚山间公路上时,突然产生的.  
今天回过头去看,PCR确实是非常简单的一个“概念”,所发生的奇迹是,其变成了一个成熟的可操作的实验系统,后者又上升为新的“概念”——基因扩增.其实在PCR发明前的十多年时间里,发明PCR的条件即均已具备,但由于人们对于基因扩增有分子克隆的方法,因而在Mulis之前就没有人去想过要寻找更为迅捷的途径.有哲人说过,机遇偏爱有准备的头脑.如果Mulis博士不是在从事DNA测序方面的工作,如果他不是一个总爱动脑想问题的人,如果他不是对迭代计算及计算机有浓厚的兴趣,也许PCR的发明不知会等到哪一天.Mulis在思考更简便的双脱氧核酸测序方法中,PCR这个概念突然在其脑海里迸发了出来,从而使后来从事生命科学研究的科研人员得到了一个zui有力的工具.可以说,PCR不是为解决某一个难题而诞生的,很有意思的是,在PCR发明后,各种各样需要用PCR来解决的难题才一个接一个地出现在人们面前.  
二、耐热DNA聚合酶的应用  
在PCR的发展史上,另外值得一提的是,耐热DNA聚合酶的纯化获得.PCR在1983年发明后,由于PCR的操作过程中,需要反复加热变性与降温复性的步骤,而前一次扩增循环所使用的大肠埃希菌DNA聚合酶在下一个扩增循环的高温下就变性了,因此在每一次冷热循环之后,都要加入新鲜的DNA聚合酶——大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段.其缺点是:①Klenow酶不耐高温,90℃会变性失活.②引物链在模板上的延伸反应是在37℃下进行的,模板和引物之间容易发生碱基错配,因而特异性较差,合成的DNA片段不均一.因此,原始的PCR不但烦琐,而且价格昂贵.因此,那时PCR并没有显示出太大的商业应用价值,也没有引起生物医学界的足够重视.  
1985年春,Mulis首次提出应该使用能够耐受PCR过程中DNA变性时的高温而不会导致DNA酶活性丧失的热稳定的聚合酶的想法,当时在全球主要有两个实验室从事嗜热菌的研究,一个在美国,一个在俄罗斯.后来他们在美国的那个研究所得到分离自黄石国家公园温泉的嗜热菌(Thermusaquaticus)株.Mulis虽然提出将TaqDNA聚合酶应用到PCR的建议,但并没有现成的商品制剂可用,必须自己分离纯化.但当时Cetus公司蛋白质化学研究人员都在忙于自己的工作,没有人帮他纯化,他自己又不愿意干.后来,公司不得不让其他人进行该项工扼要的解释:PCR的起始材料“靶序列”是作,他们按着先前研究人员发表于1976年的DNA上的一个基因或片段.在几个小时内该目标序列能被扩增超过100万倍.双链步骤,三周就分离出纯化的TaqDNA聚合酶.1986年6月,Saiki首次将其应用于PCR,效果就好得惊人,可说是一战成功.TaqDNA聚合酶具有以下特点:①耐高温.70℃以下2h后,其仍会保留大于原来的90%的酶活性.93℃以下2h后,残留活性是原来的60%.95℃以下2h后,残留性是原来的40%.因此,在通常的PCR中,不必每次扩增扩增效率增加了扩增长度,.DNAPCR聚合酶不但大大简化了工作同时,Sicence后加入新的酶.②由于延伸温度较高(通常为72℃),因而大大提高了扩增特异性、灵敏度和专一性及活性都比之前使用的酶更强,至此,有关PCR应用的zui大的瓶颈问题迎刃而解.再加上PCR仪的成功研制,此时的PCR展现了巨大的商业应用价值.  
在有关TaqDNA聚合酶的论文1988年在上发表后,1989年12月杂志将PCR所使用的耐热的DNA聚合酶命名为第*个“年度分子”,该刊编辑KoGshlandJr..和Guyer对PCR作了一个简明SicenceDNA分子的互补链经加热后解开.所谓引物就是两条很短的合成DNA,它们分别与目标序列两端的特定序列互补.每个引物都与它的互补序列相结合,于是,聚合酶就能从引物处开始复制它的互补链,在非常短的时间内产生与靶序列完全相同的复制品.在后续的循环中,无论是起始DNA还是其复本的双链分子都被分开成单链,引物再次与其互补序列结合,聚合酶也再度复制模板DNA.多次循环以后,样品中靶DNA序列的含量大大增加,经扩增后的遗传物质就能被用于进一步的分析研究.在完全用分子生物学技术术语描述了PCR以后,他们断言:第*批有关PCR技术的论文发表于1985年.自那以后,PCR已经发展成为日益强大和用途广泛的技术.1989年的PCR“爆炸”,可以看作是方法论上的改良与优化,在PCR基本要素基础上的技术革新不断出现,越来越多科学家掌握了PCR技术.有了PCR,极少量嵌入的或者遮蔽的遗传物质也能被扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于鉴定和分析的材料.  
第二节PCR的基本原理  
下面我们来简单叙述一下PCR的基本原理:PCR的基本过程类似于DNA的天然复制,特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.整个过程由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成.①模板DNA变性:模板或经PCR扩增形成的DNA经加热至94℃左右一定时间后,双链之间氢键断裂,双股螺旋解链,变成两条单链,以便它与引物结合,为下一轮反应做准备.②模板DNA与引物的退火(复性):DNA加热变性成单链后,当温度降至一定程度(55℃左右)时,引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合.③引物的延伸:在TaqDNA聚合酶的作用下,DNA模板上的引物以dNTP为原料,按AGT、CGG碱基配对与半保留复制原则,合成一条新的与模板DNA链互补的链.重复上述变性-退火-延伸的循环过程,每一循环获得的“半保留复制链”都可成为下次循环的模板.通常,每完成一个循环需时2~4min,2~3h就能将靶核酸扩增放大几百万倍.从图中可知,在PCR的第*和第二个循环,并没有短的目的片段,只是在第三个循环后才有,并且部分双链的长片段将始终伴随整个扩增过程(图1-1).  
图1-1PCR的基本原理  
第三节PCR的反应动力学  
上述PCR的三个反应步骤循环往复,使(图1G2).得特定长度的靶DNA数量呈指数上升.在理论上,终产物DNA的量可用Yn=X..2计算.其中X为原始模板的数量,为循环后DNA片段终产物的拷贝数,n为扩增循环数.但在实际扩增过程中,不可能达到理想状况下的100%扩增效率,因此,公式可以(1+E)来代替,而得到n,Yn=X(1+E)E为平均扩增效率,理论值为100%,亦即为1,但在实际反应中平均效率达不到理论值.  
扩增起始期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,但随着扩增产物的逐渐累积,其对扩增过程出现负作用,再加上酶的消耗疲劳,整个扩增将进入线性增长期或平台期,此时,扩增产物不再呈指数增加,出现“停滞”.  
图1-2PCR的反应动力学  
第四节PCR的扩增体系和扩增条件  
一、PCR扩增体系的基本要素  
一个完整的PCR扩增体系主要由引物、酶、dNTP、模板和Mg2+等基本要素所组成.  
(一)引物设计的原则  
引物不但决定了PCR扩增片段的长短,而且也是PCR扩增特异性的关键,要保证PCR扩增的特异性,引物一定要与模板DNA具有完全的互补性.理论上,任何模板DNA,只要其核苷酸序列是已知的,就能按其序列设计合成一定长度的互补寡核苷酸链做引物,从而将特定长短的靶DNA在体外大量扩增.  
1.引物设计的一般原则引物长度以18~30bp为宜,以20bp左右zui为常用.引物过短,易导致非特异扩增.较长的引物虽特异性好,但在引物内易形成二级结构,如发夹环(hairpinloop).  
(1)引物扩增跨度(扩增片段长短):扩增片段在普通的PCR以200~500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段.而实时荧光PCR则为70~150bp.  
(2)引物G+C比例及碱基:G+C含量以40%~60%为宜,G+C比例太低扩增效果不佳,G+C比例过高易出现非特异条带.此外,ATGCzui好随机分布,避免出现重复的基序(repeatmotif).重复的基序通常包括简单重复如4个以上核苷酸的重复序列(GCCAGCTGCCAGCTG)、倒装重复如4个或4个以上核苷酸自我互补序列基序(GTTACCGGCGGTAAG)和均一的多聚核苷酸的成串排列如4个或4个以上的相同的核苷酸(GTTTTTG).  
(3)引物的熔解温度(Tm):引物的Tm与其长度、序列组成(G+C比例)和浓度有关,通常,理想引物的Tm应在55~60℃.引物的Tm对PCR扩增的特异性影响较大.引物对之间的Tm的差异应不超过2~3℃,如差异过大,扩增效率将大大降低,甚至不出现扩增,因为如果引物Tm较高,当在低于理想的退火温度时,将出现错误的扩增引导.如果Tm较低,则引物只在于高于理想的退火温度时以低浓度结合.引物的Tm可按下式计算,即Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C),退火温度的选择通常是低于Tm约5℃.  
(4)引物内部的二级结构:引物内部应避免出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3′端的互补,否则,由于在PCR中,相对扩增靶核酸,其浓度较高,而很容易出现引物间的退火,形成引物二聚体,在琼脂糖凝胶电泳时,可出现非特异的扩增条带.避免引物二级结构出现的简单方法是,选择50%G+C和无4个连续相同碱基的引物.  
(5)引物的3′端碱基:引物的3′端碱基,尤其是zui末及倒数第二个碱基,应严格配对.末端碱基不配对易导致PCR失败.在引物的3′端碱基,zui好为G或C,而形成所谓的“GC夹子(GCclamp)提高引发效率.“GC夹子”由于G—C间的三个氢键,而有助于引物3′端的正确结合,使得扩增的特异性增强.  
(6)引物的特异性:引物初步设计好后,应与核酸序列数据库(Genebank)的已知序列进行比对,应与已知序列无明显同源性.  
(7)引物量:每条引物的浓度不宜过高,如能得到理想的扩增,则引物浓度越低越好.引物浓度偏高易导致错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会.  
(8)酶切位点的考虑:如是为分子克隆或限制性酶切的目的进行扩增,则引物中通常要加上合适的酶切位点.  
(9)对于GC含量高的靶核酸的扩增引物:扩增GC含量高的靶DNA,建议使用具有较高Tm的引物,如75~80℃.这样在进行PCR扩增时,可采用较高的退火温度,以利于引物的退火,从而提高扩增效率.  
2.用于多重PCR的引物设计原则多重PCR即是在一个PCR扩增体系中,含有数对引物,同时扩增数个靶核酸.通常,由于在一个扩增体系中,PCR引物对越多,越容易出现引物二聚体,以及出现非特异的扩增,因此,多重PCR通常也只能限于5~10靶核酸.多重PCR中,如果不同的引物对均能以相同的扩增效率进行扩增,则较为理想.通常很难预知一对引物的扩增效率,但在同一反应条件下,退火温度相近的话,将是较好的选择.  
多重PCR引物的设计除了要考虑上述引物设计的一般原则外,还应考虑以下内容.  
(1)引物的长度:每对引物的长度应控制在18~24bp.引物越长,越容易导致引物二聚体的形成.  
(2)引物的Tm:每对引物的Tm应该接近.  
(3)引物的3′端:避免引物对3′端的碱基互补.  
(4)退火温度和循环数:这两个方面对多重PCR非常重要.引物的退火温度越高越好,首先确定每对引物的退火温度,在多重PCR中,使用引物对中zui低的温度作为退火温度,同样,使用zui少的扩增循环数.  
(5)延伸时间:由于多重PCR同时扩增多个模板,因而较扩增单一靶核酸的PCR方法需要较长的延伸时间.  
总而言之,所设计好的每对引物,在组装成多重PCR前,都应单独进行实验,以确定zui佳的扩增条件.  
3.“巢式(nested)”PCR引物的设计原则“巢式”PCR即是针对同一靶核酸设计一对外引物和一对内引物,先用外引物进行扩增,再用内引物扩增,以提高PCR检测的敏感性.但这种方法通常需要在第*轮扩增