前言：

"在对老油田开发过程中，提高石油采收率已成为当前老油田开发的中心任务。经过开采以后，大量的残余油滞留在地下,因而如何利用残存在油藏中的石油成为一项重要课题。本书涉及的微生物降解石油烃产甲烷技术，将成为对残余石油进行利用的一条有效途径。

目前大部分的石油污染土壤生物修复的基础研究主要集中在好氧生物修复，本书针对石油污染土壤生物修复的实际情况进行了厌氧降解菌的基础探讨，为厌氧生物修复技术提供了理论基础；同时对石油污染土壤生物修复的土壤理化性质和石油烃组分的纵向分布进行了阐述，并使用纵向分布特征对厌氧生物修复技术的可行性进行了分析；系统地阐述了厌氧微生物对石油烃及石油烃模式物的降解特性，建立相关降解动力学模型，并通过多种分析手段对降解特定的石油烃化合物进行了代谢途径的推测；将传统培养分离方法和现代分子生物学方法相结合阐述了厌氧微生物的群落结构和多样性，对厌氧混合菌在不同的石油烃模式物下的微生物群落结构和多样性进行了分析。

本书阐述从油井采出液和含油污泥中筛选的降解石油烃产甲烷菌群，系统阐述温度和压力条件对产甲烷菌群的影响，运用高温模拟蒸馏和离子色谱仪分析产甲烷菌群对石油的降解情况。通过同位素13C示踪方法阐述降解石油烃产甲烷的微生物菌群，并且利用二维高效液相色谱-质谱分析菌群降解副产物。

本书共分为7章，其中第1章绪论，第2章降解石油烃产甲烷菌群的初筛，第3章高效产甲烷菌群的建立，第4章混合菌中单菌鉴定及混合菌培养条件的优化，第5章生长激活剂对菌群产甲烷的影响，第6章降解石油烃产甲烷的机理初探以及第7章的结论及展望。全书具有较强的技术性和针对性，适用于石油化工、生态环境、生物工程等领域的工程技术人员、科研人员和管理人员参考，也可供高等学校环境科学与工程、生态工程、化学化工及相关专业师生参阅。

本书主要选取多口油井采出液和油田含油污泥，分析其中的厌氧降解石油烃产甲烷菌群；其中油田采出液（YH）和含油污泥（TH）均按照厌氧条件培养。经过初筛，油田采出液中YH5菌群的甲烷产量最高。含油污泥样品中，TH2菌群的甲烷产量最高；而后将YH5和TH2两种菌群混合配比，最终得到混合后的产甲烷菌群HYH5。在相同条件的培养基中，HYH5菌群与YH5菌群、TH2菌群相比，高于YH5菌群和TH2菌群的甲烷产量。在HYH5菌群降解石油烃产甲烷前后红外光谱分析表明：降解后出现了3380 cm-1的振动峰，表明有羟基类化合物产生。并且通过气相色谱-质谱和高温模拟蒸馏仪分析降解后的石油样品表明：石油中的部分饱和烃被微生物降解，而通过离子色谱仪分析HYH5菌群的降解产物，发现有长链酸存在，如十六酸、十八酸、二十酸、二十二酸。而在考虑温度和压力对HYH5菌群产甲烷的影响，在其他培养条件都相同的情况下，低温30℃时，其甲烷产量最高，高温60℃时，其甲烷产量较低。而压力对HYH5菌群降解石油烃产甲烷也有显著影响，在常压下，HYH5的甲烷产量较高，在高压15MPa下较低。本书对厌氧混合菌群HYH5中的单菌多次分离、纯化，共获得三株降解石油烃的单菌，分别命名为 HYH5-1、HYH5-2和HYH5-3。通过提取菌株 HYH5-1、 HYH5-2和HYH5-3的DNA，对其16S rDNA V3区进行扩增，比对得到16S rRNA的部分序列，鉴定出HYH5菌群中的单菌HYH5-1与Thermodesulfobiaceae bacterium enrichment culture clone 相似性最高，而HYH5-2与另一株厌氧降解石油烃产甲烷菌相似，相似度达到97%，对HYH5-3的序列进行比对，表明其与Uncultured Methanomethylovorans sp.clone最相似，为高温油藏中的产甲烷古菌，八叠球菌属。本书研究还表明：相对于其他表面活性剂，生物表面活性剂明显提高HYH5菌群降解石油烃产甲烷的效果；同时碳酸氢盐也可以促进HYH5菌群产甲烷。钼离子和锌离子的共同作用也可以提高其甲烷产量，但是相对于锌离子，钼离子的促进作用更明显。并且硝酸盐和硫酸盐的共同作用，也提高了HYH5菌群的甲烷产量。利用高效液相色谱-质谱鉴定出一种脂肽类物质，这种物质也可以促进HYH5菌群更高效地产甲烷。本书利用13C标记甲苯的方法来研究HYH5菌群中降解甲苯的菌群，得知：甲苯降解后的主要产物为苯甲酸、延胡索酸、苯甲酰琥珀酸等，其降解甲苯是延胡索酸加成反应。而且其降解正十六烷的产物主要是十烷二羧酸、十四烷二羧酸、十五烷酸、十六烷酸，其降解十六烷主要进行了羧基化反应。

本书编写过程中参考了国内外学者的最新研究成果，在每章后虽尽力对引用参考文献给以标注，但恐有遗留，在此深表感谢和歉意。感谢临沂大学的大力支持；同时在写作过程中也得到了卢金荣、申洪源、梁仁君、王梁、赵敏、李宝等老师的大力支持，以及韦安培、傅敏、丁文超、房媛等同志的大力协助，在此一并表示感谢!

限于著者水平和编写时间，书中难免有不足和疏漏之处，敬请读者批评指正。

著者

于山东省水土保持与环境保育重点实验室

2018年8月15日"

目录：

"第1章绪论/001

1.1降解石油烃产甲烷的研究背景002

1.2降解石油烃产甲烷的目的和意义003

1.3降解石油烃产甲烷的国内外研究进展005

1.3.1降解石油烃产甲烷的功能菌群008

1.3.2影响微生物厌氧降解产甲烷的条件018

1.3.3石油降解的副产物019

1.3.4石油烃厌氧代谢机理019

1.3.5降解石油烃产甲烷的微生物分析方法021

1.4主要研究内容及技术路线022

1.4.1主要研究内容022

1.4.2主要技术路线023

参考文献024

第2章降解石油烃产甲烷菌群的初筛/038

2.1主要仪器和试剂043

2.1.1主要仪器043

2.1.2主要试剂043

2.2实验设计和方法045

2.2.1实验设计045

2.2.2实验方法048

2.3实验结果与讨论054

2.3.1采出液理化性质分析054

2.3.2YH5和TH2菌群的初筛055

2.3.3产甲烷前后石油烃的变化060

2.3.4YH5和TH2菌群结构的分析064

2.4本章小结070

参考文献071

第3章高效产甲烷菌群的建立/079

3.1主要仪器和试剂085

3.1.1主要仪器085

3.1.2主要试剂086

3.2实验设计和方法087

3.2.1实验设计087

3.2.2实验方法089

3.3实验结果与讨论090

3.3.1温度和压力的模拟系统气密性和安全性分析090

3.3.2YH5和TH2的配比分析及HYH5的建立092

3.3.3产甲烷菌群HYH5降解石油的分析095

3.3.4温度和压力对HYH5降解石油烃产甲烷的影响100

3.4本章小结104

参考文献106

第4章混合菌中单菌鉴定及混合菌培养条件的优化/111

4.1主要仪器和试剂112

4.1.1主要仪器112

4.1.2主要试剂112

4.2实验设计和方法112

4.2.1实验设计112

4.2.2实验方法114

4.3实验结果与讨论117

4.3.1HYH5和YHH6混合菌群中单菌的分离鉴定117

4.3.2接种量对HYH5菌群的影响126

4.3.3初始pH值对HYH5菌群的影响126

4.3.4初始盐度对HYH5菌群的影响127

4.3.5石油浓度对HYH5菌群的影响127

4.3.6采油剂聚丙烯酰胺对HYH5菌群的影响128

4.4本章小结129

参考文献131

第5章生长激活剂对菌群产甲烷的影响/133

5.1主要仪器和试剂134

5.1.1主要仪器134

5.1.2主要试剂134

5.2实验设计和方法135

5.2.1不同表面活性剂对HYH5混合菌群产甲烷的影响135

5.2.2不同碳源对HYH5菌群产甲烷的影响135

5.2.3钼离子和锌离子对HYH5菌群产甲烷的影响136

5.2.4硫酸根和硝酸根电子受体对HYH5菌群产甲烷的影响136

5.2.5YHH6副产物对HYH5菌群产甲烷影响137

5.3实验结果与讨论138

5.3.1不同表面活性剂对HYH5混合菌群产甲烷的影响138

5.3.2不同碳源对HYH5菌群产甲烷的影响139

5.3.3钼离子和锌离子对HYH5菌群产甲烷的影响140

5.3.4硫酸根和硝酸根电子受体对HYH5菌群产甲烷的影响140

5.3.5红外光谱和高效液相色谱分析YHH6副产物142

5.3.6YHH6副产物对HYH5菌群产甲烷的影响143

5.4HYH5厌氧产甲烷菌群的应用144

5.5本章小结145

参考文献146

第6章降解石油烃产甲烷的机理初探/149

6.1主要仪器和试剂151

6.1.1主要仪器151

6.1.2主要试剂151

6.2实验设计和方法151

6.2.1实验设计151

6.2.2实验方法152

6.3实验结果与讨论153

6.3.1HYH5菌群降解同位素标记的甲苯153

6.3.2HYH5菌群降解链烃的分析157

6.4本章小结158

参考文献158

第7章结论及展望/160

7.1结论161

7.2展望162

附录/164

附录1：紫外分光光度法测定采出水中总氮165

附录2：DNA提取仪器设备168

附录3：DNA提取步骤168

附录4：DGGE标准操作方法169

附录5：降解菌的生理生化特性实验170

附录6：细菌基因组DNA提取试剂盒使用方法172

附录7：基因组DNA及PCR产物琼脂糖电泳174

附录8：原油四组分分离方法175