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书名：新一代基因组测序技术
定价：128.0
ISBN：9787030487919
作者：陈浩峰
版次：1
出版时间：2016-06
内容提要：
新一代基因组测序技术是目前生命科学领域中发展非常快的新技术，它的出现极大地推动了生物学、农学和医学诊断等学科各方面的发展，其应用非常广泛。本书以新一代基因组测序技术Illumina平台和Pac Bio RS平台为代表，详细阐述了从实验样品处理到数据分析的整个过程，重点介绍了新一代测序技术实践过程中的文库构建与质检、测序仪器操作和测序数据的初步处理及分析。本书是国内第*本详细阐述新一代基因组、转录组等测序技术的中文书，包含了目前*新的技术资料，极具实用性和可操作性。
目录：
目 录
第*章 测序技术发展概述1
第*节 第*代基因测序方法简介1
第二节 新一代测序技术概述4
参考文献21
第二章 Illumina测序建库25
第*节 DNA测序建库25
第二节 转录组测序（RNA-seq）建库80
第三节 小RNA测序建库163
第四节 简化基因组测序建库184
第五节 目标序列捕获测序建库204
第六节 单细胞测序建库227
参考文献244
第三章 Illumina仪器操作246
第*节 簇生成操作流程246
第二节 测序仪HiSeq操作流程254
第三节 测序仪MiSeq操作流程268
第四节 测序仪NextSeq500 操作流程276
参考文献283
第四章 Illumina测序数据分析方法简介284
第*节 下机数据的初步处理284
第二节 DNA测序数据分析简介291
第三节 转录组测序标准信息分析304
第四节 建造中等高性能计算机群系统316
参考文献323
第五章 PacBio RS测序技术326
第*节 PacBio RS测序原理326
第二节 PacBio RS测序DNA样品准备及文库构建流程328
第三节 SMRT Potal二级分析软件的安装333
第四节 SMRT Portal数据分析流程334
第五节 PacBio RS测序应用简介348
第六节 PacBio测序案例349
参考文献350
常用英文简写列表351
在线试读：
第*章 测序技术发展概述
随着现代科学技术的发展，生命科学的研究已经进入了组学时代。基因和基因组测序技术已经成为现代生命科学研究，特别是基因组学研究中不可或缺的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学研究的空前繁荣。
自从1977年Fredrick Sanger等建立了双脱氧链终止法（dideoxy chain-termination method）测序技术以来，基因测序技术经历了几十年的快速发展，在此期间出现了两次技术上的飞跃：第*次飞跃是Sanger测序技术实现了大规模测序的自动化，科学家利用该技术完成了“人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）”等重大科学研究项目；第二次飞跃是自2005年以来，以Roche 454、Illumina GA/HiSeq、Life SOLiD/Ion Torrent、PacBio RS为代表的新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）的出现，使得基因组测序通量快速增加，测序成本极大降低。近10年来，测序技术的发展速度已经远远超*了半导体信息技术进步的速度（摩尔定律，Moore’s Law），它将生命科学研究带入了基因组学时代。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、环境保护、法医学等领域中得到了广泛的应用。
那么，新一代测序是怎样在实验室中实现的？测序实验成败的关键是什么？测序数据的产生过程是怎样的？拿到海量的测序数据之后该怎样处理？这些都是正在使用和将要学习使用新一代测序技术的广大科研人员及生命科学相关专业的高等院校师生所关心的问题。目前，对于国内绝大多数生物学和医学实验室来说，新一代测序仪和与测序相关的实验技术仍然是比较昂贵和陌生的，因此，我们编写这本书，向读者介绍一些新一代基因组测序技术的原理、测序实验操作和初步的数据分析方法，就显得十分必要了。
在本书的各个章节中，我们将针对测序技术的发展历史、测序建库、测序仪器操作、数据的初步分析等各个方面逐一为读者详细介绍。
第*节 第*代基因测序方法简介
第*代基因测序方法，即双脱氧链终止法，是由Fredrick Sanger等在1977年创立的（Sanger et al.，1977），因此，也被称为“Sanger测序法”。该方法是一种基于DNA聚合酶合成反应的测序技术。其测序原理可以简述如下（图1.1）：在4个测序反应系统中加入待测的DNA模板、DNA合成酶及DNA合成反应所需的其他成分，如脱氧核苷三磷酸（dNTP）、反应引物和缓冲液等，并且将少量的4种带有放射性同位素的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）按一定比例分别加入相应的反应系统中，然后进行DNA合成反应。因为ddNTP中包含的是双脱氧核糖，其3位碳原子上连接的不是羟基（—OH），而是脱氧后的氢（—H），所以当ddNTP被加入到正在合成的DNA链中后，系统中后续的dNTP就不能再被结合到这条DNA链上了，这条DNA链的合成就会随机终止在任何碱基处。这样，经过几十个循环的合成反应后，就形成了一组由短到长的DNA片段，这些片段之间的长度差为一个核苷酸，并且3’端碱基以带有放射性同位素标记的A、C、G或T作为结束。测序合成反应终止后，将合成的产物分为4个泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果经过放射自显影处理后，根据电泳所得到的DNA片段大小来排列反应产物带有的末端双脱氧核苷酸类型，即可反向依次读出被合成的碱基排列顺序，从而得到待测的DNA序列。
图1.1 双脱氧链终止（Sanger）测序原理图（选自Sequencing forensic analysis and genetic analysis和Genes and genomics：a short course（3e），略有改动）
A. 454测序流程图：在4个测序反应系统（tube 1、2、3和4）中加入待测DNA模板、DNA合成酶、dNTP、反应引物及带有放射性同位素的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。经过DNA合成反应后，就形成了一组长度差为一个核苷酸的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影后，根据电泳所得到的DNA片段大小可反向依次读出被合成的碱基排列顺序，从而得到待测的DNA序列。B. 基于“Sanger测序法”的荧光自动DNA测序仪直接将信号转化为DNA序列的显示图
此后，人们在上述*初的“Sanger测序法”基础上发展出多种DNA测序技术，其中*重要的是荧光自动检测技术。该技术基于Sanger测序原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大地提高了DNA测序的速度和准确性。代表性的测序仪器如ABI 3730XL测序仪拥有96条电泳毛细管，4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光进行标记，在通过毛细管末端时由激光激发不同的DNA片段上的4种荧光基团，从而发出不同颜色的荧光，荧光信号被CCD（charge coupled device）照相检测系统识别后直接将信号转换成为DNA序列。Sanger测序法在出现之后的大约30年间，因其操作简便、测序读长长（为800 bp～1 kb）、数据准确性高，一直是应用*为广泛的DNA测序方法，甚至至今仍是验证新一代测序结果的金标准，常用于验证由新一代测序方法发现的新变异位点。
第*代测序技术的产生，使人们拥有了“阅读”生物基因组秘密的有力工具，在20世纪末和21世纪初的几年间，科学家利用第*代测序技术完成了一系列物种的全基因组测序，如水稻（Goff et al.，2002）、拟南芥（The Arabidopsis Genome Initiative，2000）等模式植物和秀丽线虫（The C. elegans Sequencing Consortium，1998）、果蝇（Adams et al.，2000）等模式动物的基因组图谱。该技术*大的成就是保证了“人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）”的顺利实施（Lander et al.，2001），这项跨国研究计划开始于1990年，2000年美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）和美国Selera公司共同宣布人类基因组草图绘制成功；2003年由美、日、德、法、英、中六国科学家宣布人类基因组序列图谱绘制成功。人类基因组计划历时13年，花费约30亿美元，由全世界几千个实验室协力共同完成。美国著名的《时代》（TIME）杂志在2000年发表文章评论这项成就的意义时这样写道，“……无论怎样评价这项成就都不为过。以遗传密码作武器，科学家现在可以以很轻松的方式（teasing out）在分子水平上获得人类健康和疾病的秘密——至少可以在阿尔茨海默病、心脏病和癌*的诊断和治*等方面引发一场革命……历史将记载下这一基因组时代开启的时刻”。
尽管Sanger测序法至今仍然被公认为测序的“金标准”，但是它也存在着相当大的局限性。第*是“测序偏好（sequencing bias）”，由于Sanger测序法是将待测DNA加入到载体（vector）上并在大肠杆菌（Escherichia coli）等细菌中进行克隆，因此被克隆的DNA不能对细菌有害，并且要与细菌DNA的复制机制兼容。测序实验证明，基因组的某些区域，如着丝点和端粒附近的区域很难被克隆，从而导致在基因组测序数据中出现缺失（gap）。第二是Sanger测序法处理和分析等位基因频率的能力有限，用这种测序方法在PCR扩增产物中发现并区分杂合的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是很困难的。第三是Sanger 测序法通量太低，从而导致基因组测序实验成本过高。据估算，用Sanger测序法完成一个人基因组（约为3′109个碱基）的重测序大约需要1000万美元，这样就使得一般的实验室无力单独承担大规模的测序实验研究项目。
第二节 新一代测序技术概述
人类基因组计划的顺利实施，是全世界科学家利用第*代测序技术所取得的辉煌成就，同时也标志着生命科学研究进入了后基因组时代，即功能基因组时代。传统的第*代测序技术因其通量低、成本高和时间长的局限性，已经不能满足生物物种的深度测序和重测序等大规模基因组测序的需要，这就促使了新一代基因组测序技术的诞生。依照其在测序市场上出现的时间顺序，新一代测序技术包括Roche 454公司的Genome Sequencer FLX测序平台，Illumina公司的Genome Analyzer、HiSeq系列、MiSeq、NextSeq500和MiniSeq等测序平台，Life公司的SOLiD测序平台、Ion Torrent Personal Genome Machine（PGM）、Proton等测序平台，Helicos Biosciences公司的Heliscope测序平台，Pacific BioSciences公司的RS测序平台，以及新近出现在测序市场上的Oxford Nanopore公司的MinION、PromethION、GridION等测序平台。新一代测序技术*显著的特点是通量高，单碱基测序成本低，一次测序运行可以对几十万至数亿条DNA模板进行测序。利用这些特点，人们可以方便地对各种生物物种进行全基因组深度测序、转录组测序、甲基化测序和ChIP测序等研究。
在第*代测序技术中，测序合成反应，即通过测序PCR产生长度不同（不同片段之间相差一个脱氧核苷酸）的扩增片段，与序列读取（通过电泳方法分离与检测片段长度）及产生序列数据的过程是分离的。与之相比，新一代测序技术通常又被称为大规模平行测序技术（massively parallel sequencing，MPS），它可以同时完成测序模板互补链的合成与序列数据的读取。一般来说，新一代测序包含下列连续的步骤：①向测序系统加入脱氧核苷酸；②检验和确定被加入的脱氧核苷酸类型；③去除测序反应的各种酶、荧光标记物或脱氧核苷酸的3′阻断基团等的洗脱反应（Zhang et al.，2011）；这样就实现了“边合成边测序（sequencing by synthesis，SBS）”，如454、Illumina、Ion Torrent和PacBio等测序技术；或者“边连接边测序（sequencing by ligation，SBL）”，如SOLiD技术。
新一代测序技术的发展初期，得到的测序读长相比第*代测序数据（0.8～1 kb）来说都比较短，因此在当时新一代测序方法也被称为“短序列测序方法（short reads sequencing）”。例如，在2009年前后，454测序读长是400～500 bp，在同时期的新一代测序平台中是*长的。与之相比，Illumina GA和SOLiD当时的读长是35～50 bp，它们读长的主要受限因素是信噪比（signal-to-noise ratio）低。在这之后的数年间，Illumina推出了HiSeq系列和MiSeq测序平台，逐渐把测序读长加长到双端150 bp（HiSeq）和双端300 bp（MiSeq），拉近了与第*代测序法读长的距离。*近1～2年，随着PacBio RS和Oxford Nanopore单分子测序平台的推出，新一代测序的读长也迅速提高，达到了几kb到数十kb的水平，远远超*了第*代测序法的读长。
目前有关新一代测序技术的名称有多种说法，有人把PacBio RS和Oxford Nanopore的测序平台称为第三代测序技术，以区别于Illumina、SOLiD等第二代测序技术，其根据是它们实现了单分子实时测序，省去了第二代测序技术中的模板扩增步骤。但作者认为，这两种测序技术虽然与第二代测序技术有所区别，但仍然存在通量偏小，测序初始数据准确率不高的问题，在测序方法上和第二代测序技术相比并没有可以称得上“代差”水平的改进。所以在本书中我们没有把PacBio和Nanopore称为第三代测序技术，而是和原有的第二代测序技术一起统称为“新一代测序技术”。
下面按照测序技术出现的时间顺序，简要介绍6种主要的新一代测序平台的测序原理和技术特点。
一、Roche 454焦磷酸测序技术
2005年，454公司推出了第*款二代测序仪Genome Sequencer 20。2007年，又推出了改进型测序仪Genome Sequencer FLX和小型化测序仪GS Junior。该测序平台利用了焦磷酸测序原理和边合成边测序技术，得到的序列平均长度为400～500 bp，通量为每次测序运行产出0.7 Gb左右数据。相比同期的Illumina Genome Analyzer和SOLiD测序平台，454 GS平台得出的序列读长较长（同期的Illumina和SOLiD读长只有35～50 bp），有利于基因组数据的拼接，尤其适用于小型基因组如细菌基因组的从头测序（de novo sequencing），因而在一段时间内得到了广泛的应用（Mardis，2008；Rothberg and Leamon，2008）。但在新一代测序平台中，454的测序通量相对较小，单碱基测序成本高，很快被Illumina等后续出现的测序平台超*，*终罗氏公司于2014年宣布454退出测序技术竞争，遗憾离场。虽然如此，454平台仍然在新一代测序技术的发展史上留下了浓重的一笔，科学家利用454测序技术作出过很多出色的工作，获得过一些重大的发现，如美国贝勒医学院人类基因组中心的Wheeler等（2008）利用454测序技术完成了DNA双螺旋结构发现者之一詹姆斯×沃森（James Watson）的个人基因组测序等。所以读者仍然有必要对454测序技术的原理有所了解。
454测序技术原理（以基因组DNA测序为例，图1.2）（Margulies et al.，2005）如下。
测序文库制备：将符合测序要求的基因组DNA用物理剪切的方法（例如，Covaris、nebulizer或Bioruptor等方法）打断为400～800 bp的片段，经一系列建库操作，在单链DNA的3′端和5′端加上454建库的接头，形成测序文库。
乳化PCR扩增（emulsion PCR，emPCR）：按照一定比例将单链测序文库与454测序特有的微球（bead）混合，该微球直径为28 mm，表面带有和文库一端接头的DNA互补的寡核苷酸，文库与微球连接固定后，在理想的状态下，一个微球只与一条单链文库DNA结合。然后将带有文库DNA的微球置于油相与水相的混合系统中，其中水相部分带有PCR扩增所需的所有成分（DNA酶、dNTP和扩增引物等），经机械振荡形成乳化混合物（俗称“油包水”混合物），即微小的水滴散落在油相中。由于微球具有亲水性，它们存在于“油包水”混合物的“水相”中。在绝大多数情况下，一个水滴中只含有一个微球。这样每一个水滴就形成了一个独特的PCR扩增微反应器，每个文库片段在各自的微反应器中进行PCR扩增（50个循环），*终产生数百万个相同的拷贝。接着利用一系列特定的方法打破“油包水”混合物，选择出带有扩增文库的微球用于测序。
测序：454系统使用PTP板（pico titer plate）作为测序的承载体，PTP板是经蚀刻技术处理的玻璃板，其中一面约有4′106个直径为45 mm的小孔（well）。将带有扩增文库的微球放入PTP测序板上，经离心处理后使微球进入小孔中，每个小孔的直径大小（45 mm）使其只能容纳一个微球（直径28 mm）。同时，测序反应和荧光发生所需要的各种酶和发光反应底物等也以更加微小的微珠承载，被置入小孔中，围绕在测序微球周围。这样，每个小孔就成为一个微型测序单元。454测序系统按照T、A、C和G的固定顺序依次将测序所需的dNTP加入到PTP板上，每次只加入一种碱基，在DNA合成酶的催化作用下发生DNA合成反应。如果在某个测序单元内发生与测序模板碱基配对的合成反应，该反应就会释放一个焦磷酸。焦磷酸在ATP磷酸化酶的作用下与相应底物合成ATP，而ATP在荧光
定价：128.0
ISBN：9787030487919
作者：陈浩峰
版次：1
出版时间：2016-06
内容提要：
新一代基因组测序技术是目前生命科学领域中发展非常快的新技术，它的出现极大地推动了生物学、农学和医学诊断等学科各方面的发展，其应用非常广泛。本书以新一代基因组测序技术Illumina平台和Pac Bio RS平台为代表，详细阐述了从实验样品处理到数据分析的整个过程，重点介绍了新一代测序技术实践过程中的文库构建与质检、测序仪器操作和测序数据的初步处理及分析。本书是国内第*本详细阐述新一代基因组、转录组等测序技术的中文书，包含了目前*新的技术资料，极具实用性和可操作性。
目录：
目 录
第*章 测序技术发展概述1
第*节 第*代基因测序方法简介1
第二节 新一代测序技术概述4
参考文献21
第二章 Illumina测序建库25
第*节 DNA测序建库25
第二节 转录组测序（RNA-seq）建库80
第三节 小RNA测序建库163
第四节 简化基因组测序建库184
第五节 目标序列捕获测序建库204
第六节 单细胞测序建库227
参考文献244
第三章 Illumina仪器操作246
第*节 簇生成操作流程246
第二节 测序仪HiSeq操作流程254
第三节 测序仪MiSeq操作流程268
第四节 测序仪NextSeq500 操作流程276
参考文献283
第四章 Illumina测序数据分析方法简介284
第*节 下机数据的初步处理284
第二节 DNA测序数据分析简介291
第三节 转录组测序标准信息分析304
第四节 建造中等高性能计算机群系统316
参考文献323
第五章 PacBio RS测序技术326
第*节 PacBio RS测序原理326
第二节 PacBio RS测序DNA样品准备及文库构建流程328
第三节 SMRT Potal二级分析软件的安装333
第四节 SMRT Portal数据分析流程334
第五节 PacBio RS测序应用简介348
第六节 PacBio测序案例349
参考文献350
常用英文简写列表351
在线试读：
第*章 测序技术发展概述
随着现代科学技术的发展，生命科学的研究已经进入了组学时代。基因和基因组测序技术已经成为现代生命科学研究，特别是基因组学研究中不可或缺的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学研究的空前繁荣。
自从1977年Fredrick Sanger等建立了双脱氧链终止法（dideoxy chain-termination method）测序技术以来，基因测序技术经历了几十年的快速发展，在此期间出现了两次技术上的飞跃：第*次飞跃是Sanger测序技术实现了大规模测序的自动化，科学家利用该技术完成了“人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）”等重大科学研究项目；第二次飞跃是自2005年以来，以Roche 454、Illumina GA/HiSeq、Life SOLiD/Ion Torrent、PacBio RS为代表的新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）的出现，使得基因组测序通量快速增加，测序成本极大降低。近10年来，测序技术的发展速度已经远远超*了半导体信息技术进步的速度（摩尔定律，Moore’s Law），它将生命科学研究带入了基因组学时代。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、环境保护、法医学等领域中得到了广泛的应用。
那么，新一代测序是怎样在实验室中实现的？测序实验成败的关键是什么？测序数据的产生过程是怎样的？拿到海量的测序数据之后该怎样处理？这些都是正在使用和将要学习使用新一代测序技术的广大科研人员及生命科学相关专业的高等院校师生所关心的问题。目前，对于国内绝大多数生物学和医学实验室来说，新一代测序仪和与测序相关的实验技术仍然是比较昂贵和陌生的，因此，我们编写这本书，向读者介绍一些新一代基因组测序技术的原理、测序实验操作和初步的数据分析方法，就显得十分必要了。
在本书的各个章节中，我们将针对测序技术的发展历史、测序建库、测序仪器操作、数据的初步分析等各个方面逐一为读者详细介绍。
第*节 第*代基因测序方法简介
第*代基因测序方法，即双脱氧链终止法，是由Fredrick Sanger等在1977年创立的（Sanger et al.，1977），因此，也被称为“Sanger测序法”。该方法是一种基于DNA聚合酶合成反应的测序技术。其测序原理可以简述如下（图1.1）：在4个测序反应系统中加入待测的DNA模板、DNA合成酶及DNA合成反应所需的其他成分，如脱氧核苷三磷酸（dNTP）、反应引物和缓冲液等，并且将少量的4种带有放射性同位素的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）按一定比例分别加入相应的反应系统中，然后进行DNA合成反应。因为ddNTP中包含的是双脱氧核糖，其3位碳原子上连接的不是羟基（—OH），而是脱氧后的氢（—H），所以当ddNTP被加入到正在合成的DNA链中后，系统中后续的dNTP就不能再被结合到这条DNA链上了，这条DNA链的合成就会随机终止在任何碱基处。这样，经过几十个循环的合成反应后，就形成了一组由短到长的DNA片段，这些片段之间的长度差为一个核苷酸，并且3’端碱基以带有放射性同位素标记的A、C、G或T作为结束。测序合成反应终止后，将合成的产物分为4个泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果经过放射自显影处理后，根据电泳所得到的DNA片段大小来排列反应产物带有的末端双脱氧核苷酸类型，即可反向依次读出被合成的碱基排列顺序，从而得到待测的DNA序列。
图1.1 双脱氧链终止（Sanger）测序原理图（选自Sequencing forensic analysis and genetic analysis和Genes and genomics：a short course（3e），略有改动）
A. 454测序流程图：在4个测序反应系统（tube 1、2、3和4）中加入待测DNA模板、DNA合成酶、dNTP、反应引物及带有放射性同位素的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。经过DNA合成反应后，就形成了一组长度差为一个核苷酸的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影后，根据电泳所得到的DNA片段大小可反向依次读出被合成的碱基排列顺序，从而得到待测的DNA序列。B. 基于“Sanger测序法”的荧光自动DNA测序仪直接将信号转化为DNA序列的显示图
此后，人们在上述*初的“Sanger测序法”基础上发展出多种DNA测序技术，其中*重要的是荧光自动检测技术。该技术基于Sanger测序原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大地提高了DNA测序的速度和准确性。代表性的测序仪器如ABI 3730XL测序仪拥有96条电泳毛细管，4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光进行标记，在通过毛细管末端时由激光激发不同的DNA片段上的4种荧光基团，从而发出不同颜色的荧光，荧光信号被CCD（charge coupled device）照相检测系统识别后直接将信号转换成为DNA序列。Sanger测序法在出现之后的大约30年间，因其操作简便、测序读长长（为800 bp～1 kb）、数据准确性高，一直是应用*为广泛的DNA测序方法，甚至至今仍是验证新一代测序结果的金标准，常用于验证由新一代测序方法发现的新变异位点。
第*代测序技术的产生，使人们拥有了“阅读”生物基因组秘密的有力工具，在20世纪末和21世纪初的几年间，科学家利用第*代测序技术完成了一系列物种的全基因组测序，如水稻（Goff et al.，2002）、拟南芥（The Arabidopsis Genome Initiative，2000）等模式植物和秀丽线虫（The C. elegans Sequencing Consortium，1998）、果蝇（Adams et al.，2000）等模式动物的基因组图谱。该技术*大的成就是保证了“人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）”的顺利实施（Lander et al.，2001），这项跨国研究计划开始于1990年，2000年美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）和美国Selera公司共同宣布人类基因组草图绘制成功；2003年由美、日、德、法、英、中六国科学家宣布人类基因组序列图谱绘制成功。人类基因组计划历时13年，花费约30亿美元，由全世界几千个实验室协力共同完成。美国著名的《时代》（TIME）杂志在2000年发表文章评论这项成就的意义时这样写道，“……无论怎样评价这项成就都不为过。以遗传密码作武器，科学家现在可以以很轻松的方式（teasing out）在分子水平上获得人类健康和疾病的秘密——至少可以在阿尔茨海默病、心脏病和癌*的诊断和治*等方面引发一场革命……历史将记载下这一基因组时代开启的时刻”。
尽管Sanger测序法至今仍然被公认为测序的“金标准”，但是它也存在着相当大的局限性。第*是“测序偏好（sequencing bias）”，由于Sanger测序法是将待测DNA加入到载体（vector）上并在大肠杆菌（Escherichia coli）等细菌中进行克隆，因此被克隆的DNA不能对细菌有害，并且要与细菌DNA的复制机制兼容。测序实验证明，基因组的某些区域，如着丝点和端粒附近的区域很难被克隆，从而导致在基因组测序数据中出现缺失（gap）。第二是Sanger测序法处理和分析等位基因频率的能力有限，用这种测序方法在PCR扩增产物中发现并区分杂合的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是很困难的。第三是Sanger 测序法通量太低，从而导致基因组测序实验成本过高。据估算，用Sanger测序法完成一个人基因组（约为3′109个碱基）的重测序大约需要1000万美元，这样就使得一般的实验室无力单独承担大规模的测序实验研究项目。
第二节 新一代测序技术概述
人类基因组计划的顺利实施，是全世界科学家利用第*代测序技术所取得的辉煌成就，同时也标志着生命科学研究进入了后基因组时代，即功能基因组时代。传统的第*代测序技术因其通量低、成本高和时间长的局限性，已经不能满足生物物种的深度测序和重测序等大规模基因组测序的需要，这就促使了新一代基因组测序技术的诞生。依照其在测序市场上出现的时间顺序，新一代测序技术包括Roche 454公司的Genome Sequencer FLX测序平台，Illumina公司的Genome Analyzer、HiSeq系列、MiSeq、NextSeq500和MiniSeq等测序平台，Life公司的SOLiD测序平台、Ion Torrent Personal Genome Machine（PGM）、Proton等测序平台，Helicos Biosciences公司的Heliscope测序平台，Pacific BioSciences公司的RS测序平台，以及新近出现在测序市场上的Oxford Nanopore公司的MinION、PromethION、GridION等测序平台。新一代测序技术*显著的特点是通量高，单碱基测序成本低，一次测序运行可以对几十万至数亿条DNA模板进行测序。利用这些特点，人们可以方便地对各种生物物种进行全基因组深度测序、转录组测序、甲基化测序和ChIP测序等研究。
在第*代测序技术中，测序合成反应，即通过测序PCR产生长度不同（不同片段之间相差一个脱氧核苷酸）的扩增片段，与序列读取（通过电泳方法分离与检测片段长度）及产生序列数据的过程是分离的。与之相比，新一代测序技术通常又被称为大规模平行测序技术（massively parallel sequencing，MPS），它可以同时完成测序模板互补链的合成与序列数据的读取。一般来说，新一代测序包含下列连续的步骤：①向测序系统加入脱氧核苷酸；②检验和确定被加入的脱氧核苷酸类型；③去除测序反应的各种酶、荧光标记物或脱氧核苷酸的3′阻断基团等的洗脱反应（Zhang et al.，2011）；这样就实现了“边合成边测序（sequencing by synthesis，SBS）”，如454、Illumina、Ion Torrent和PacBio等测序技术；或者“边连接边测序（sequencing by ligation，SBL）”，如SOLiD技术。
新一代测序技术的发展初期，得到的测序读长相比第*代测序数据（0.8～1 kb）来说都比较短，因此在当时新一代测序方法也被称为“短序列测序方法（short reads sequencing）”。例如，在2009年前后，454测序读长是400～500 bp，在同时期的新一代测序平台中是*长的。与之相比，Illumina GA和SOLiD当时的读长是35～50 bp，它们读长的主要受限因素是信噪比（signal-to-noise ratio）低。在这之后的数年间，Illumina推出了HiSeq系列和MiSeq测序平台，逐渐把测序读长加长到双端150 bp（HiSeq）和双端300 bp（MiSeq），拉近了与第*代测序法读长的距离。*近1～2年，随着PacBio RS和Oxford Nanopore单分子测序平台的推出，新一代测序的读长也迅速提高，达到了几kb到数十kb的水平，远远超*了第*代测序法的读长。
目前有关新一代测序技术的名称有多种说法，有人把PacBio RS和Oxford Nanopore的测序平台称为第三代测序技术，以区别于Illumina、SOLiD等第二代测序技术，其根据是它们实现了单分子实时测序，省去了第二代测序技术中的模板扩增步骤。但作者认为，这两种测序技术虽然与第二代测序技术有所区别，但仍然存在通量偏小，测序初始数据准确率不高的问题，在测序方法上和第二代测序技术相比并没有可以称得上“代差”水平的改进。所以在本书中我们没有把PacBio和Nanopore称为第三代测序技术，而是和原有的第二代测序技术一起统称为“新一代测序技术”。
下面按照测序技术出现的时间顺序，简要介绍6种主要的新一代测序平台的测序原理和技术特点。
一、Roche 454焦磷酸测序技术
2005年，454公司推出了第*款二代测序仪Genome Sequencer 20。2007年，又推出了改进型测序仪Genome Sequencer FLX和小型化测序仪GS Junior。该测序平台利用了焦磷酸测序原理和边合成边测序技术，得到的序列平均长度为400～500 bp，通量为每次测序运行产出0.7 Gb左右数据。相比同期的Illumina Genome Analyzer和SOLiD测序平台，454 GS平台得出的序列读长较长（同期的Illumina和SOLiD读长只有35～50 bp），有利于基因组数据的拼接，尤其适用于小型基因组如细菌基因组的从头测序（de novo sequencing），因而在一段时间内得到了广泛的应用（Mardis，2008；Rothberg and Leamon，2008）。但在新一代测序平台中，454的测序通量相对较小，单碱基测序成本高，很快被Illumina等后续出现的测序平台超*，*终罗氏公司于2014年宣布454退出测序技术竞争，遗憾离场。虽然如此，454平台仍然在新一代测序技术的发展史上留下了浓重的一笔，科学家利用454测序技术作出过很多出色的工作，获得过一些重大的发现，如美国贝勒医学院人类基因组中心的Wheeler等（2008）利用454测序技术完成了DNA双螺旋结构发现者之一詹姆斯×沃森（James Watson）的个人基因组测序等。所以读者仍然有必要对454测序技术的原理有所了解。
454测序技术原理（以基因组DNA测序为例，图1.2）（Margulies et al.，2005）如下。
测序文库制备：将符合测序要求的基因组DNA用物理剪切的方法（例如，Covaris、nebulizer或Bioruptor等方法）打断为400～800 bp的片段，经一系列建库操作，在单链DNA的3′端和5′端加上454建库的接头，形成测序文库。
乳化PCR扩增（emulsion PCR，emPCR）：按照一定比例将单链测序文库与454测序特有的微球（bead）混合，该微球直径为28 mm，表面带有和文库一端接头的DNA互补的寡核苷酸，文库与微球连接固定后，在理想的状态下，一个微球只与一条单链文库DNA结合。然后将带有文库DNA的微球置于油相与水相的混合系统中，其中水相部分带有PCR扩增所需的所有成分（DNA酶、dNTP和扩增引物等），经机械振荡形成乳化混合物（俗称“油包水”混合物），即微小的水滴散落在油相中。由于微球具有亲水性，它们存在于“油包水”混合物的“水相”中。在绝大多数情况下，一个水滴中只含有一个微球。这样每一个水滴就形成了一个独特的PCR扩增微反应器，每个文库片段在各自的微反应器中进行PCR扩增（50个循环），*终产生数百万个相同的拷贝。接着利用一系列特定的方法打破“油包水”混合物，选择出带有扩增文库的微球用于测序。
测序：454系统使用PTP板（pico titer plate）作为测序的承载体，PTP板是经蚀刻技术处理的玻璃板，其中一面约有4′106个直径为45 mm的小孔（well）。将带有扩增文库的微球放入PTP测序板上，经离心处理后使微球进入小孔中，每个小孔的直径大小（45 mm）使其只能容纳一个微球（直径28 mm）。同时，测序反应和荧光发生所需要的各种酶和发光反应底物等也以更加微小的微珠承载，被置入小孔中，围绕在测序微球周围。这样，每个小孔就成为一个微型测序单元。454测序系统按照T、A、C和G的固定顺序依次将测序所需的dNTP加入到PTP板上，每次只加入一种碱基，在DNA合成酶的催化作用下发生DNA合成反应。如果在某个测序单元内发生与测序模板碱基配对的合成反应，该反应就会释放一个焦磷酸。焦磷酸在ATP磷酸化酶的作用下与相应底物合成ATP，而ATP在荧光