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书名：分子生物学实验指导
定价：28.0
ISBN：9787030571236
作者：无
版次：1
出版时间：2018-05
内容提要：
本书是科研成果转化而来的、由递进式的实验项目组成的一个综合性课题，课题内容涵盖了重组DNA的基本流程，包含基础实验部分和拓展创新实验部分，共17个实验项目。
目录：
目录
前言
实验室守则 1
实验内容概述 2
实验一 分子生物学实验常用仪器设备 4
实验二 培养基的配制与细菌的纯化培养 7
实验三 质粒的提取 10
实验四 目的基因PCR扩增及扩增产物回收 12
实验五 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 16
实验六 PCR扩增产物与T载体的连接 20
实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备 24
实验八 重组质粒的构建及转化 26
实验九 阳性克隆的筛选鉴定 31
实验十 目的蛋白的诱导表达及检测 36
实验十一 蛋白质印迹法鉴定目的蛋白 41
实验十二 细胞中总RNA的提取 44
实验十三 逆转录PCR获取目的基因 47
实验十四 Dps融合表达载体的构建 49
实验十五 目的基因与融合表达载体重组、Dps融合蛋白诱导表达及检测 55
实验十六 目的蛋白的分离纯化 58
实验十七 目的蛋白的功能鉴定 63
参考文献 68
附录1 常用试剂及其配制 69
附录2 常用实验材料保存方法 80
附录3 常用仪器设备使用说明及使用注意事项 81
附录4 实验时间安排建议 88
附录5 实验小贴士 90
附录6 实验报告格式 91
在线试读：
实验室守则
1.穿着要整洁规范，进入实验室必须穿实验服。
2.实验室内禁止带入食品，勿高声谈话。
3.实验前应当认真预习，熟悉实验内容，了解所用仪器用具；实验应严格按操作规程进行，认真操作、仔细观察，及时记录实验现象及结果；实验结束后，仔细分析和总结实验结果，认真撰写实验报告。
4.许多溶剂，如三氯甲烷（氯仿）、异戊醇、异丁醇、正丁醇、甲醛和乙醚，应在通风橱中使用或使用时注意通风，并注意保护呼吸道、皮肤和衣物。有些试剂可能是致癌物或诱变剂，如溴化乙锭、甲酰胺、丙烯酰胺等，在操作中应注意防护，并注意使用后的处理。注意防止紫外线对皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。
5.各种试剂在使用前都应认真阅读使用说明，特别是一些试剂盒，在掌握相关知识后方可使用。
6.实验室中所有仪器都应向有使用经验的人请教后或阅读仪器使用说明书后方可使用。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障立即报告，不得擅自拆检。仪器使用后使用人要如实填写使用登记表。
7.实验台应当保持整洁，仪器、药品摆放整齐，使用过的器具及玻璃器皿应洗净后放回原处。试剂应规范、节约使用。公用试剂使用完毕后，应立即盖好放回原处。
8.实验结束后整理好自己的实验用品，清理实验区域，做好卫生，并注意实验室水、电、门、窗等方面的安全。
实验内容概述
1.课题名称
大肠杆菌Dps及其融合蛋白表达载体的构建、诱导表达、分离纯化和功能鉴定
2.研究背景和目的意义
DNA结合蛋白（DNA-binding protein from starved cell，Dps）是存在于古生菌及细菌中的一类抗压力蛋白，属于铁蛋白超家族。每一个Dps单体的分子质量为18.7kDa，Dps单体能够通过自组装机制形成十二聚体，发挥多种生理功能，它既能通过亚铁氧化酶活性，结合铁离子对氧化压力做出应答，又能在氧化并储存铁的同时去除H2O2与Fe（Ⅱ）的毒性，从而保护DNA、蛋白质及膜脂免受自由基损伤。另外，在铁、铜、辐射、高盐、酸、碱、饥饿或营养不足等环境胁迫下，一些细菌的Dps还能非特异性结合DNA，形成一个高度有序且稳定的Dps-DNA复合体，使染色体从松散易受损伤形态转变为凝集紧实状态，起到保护DNA免受损伤的作用。
本实验以大肠杆菌（Escherichia coli， E.coli）基因组为模板，对其dps基因进行扩增，并在其下游引入His-Tag，重组到pBV220载体上构建pBV-dps-6his原核表达载体，利用亲和层析分离纯化目的蛋白并通过蛋白质印迹实验进行鉴定；根据蛋白质是否能自组装成十二聚体并与DNA结合、保护DNA免受自由基氧化损伤等特点检测表达蛋白的功能。
在pBV-dps-6his原核表达载体基础上构建pBV-dps-2x-6his原核表达载体，其中2x为引入的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点，可将其他目的基因，如抗原表位序列或通过RT-PCR获得的真核生物基因等插入此位点，诱导表达Dps融合蛋白。
通过基因工程表达的Dps及其融合蛋白，可进行蛋白质抗氧化保护作用、抗原表位的免疫原性等生物学功能方面的研究。本课题内容综合性强，包含了基因工程（重组DNA技术）的关键设计思路和基因操作的常用方法。
3.实验流程图
4.内容模块
基础实验内容：大肠杆菌Dps表达载体的构建、诱导表达及检测鉴定。
（1）质粒和目的基因（dps基因）的获取与检测。
（2）pBV-dps-6his表达载体构建及Dps-6his蛋白诱导表达及检测鉴定。
拓展创新实验内容：Dps融合表达载体的构建、表达蛋白的分离纯化及功能鉴定。
（3）PCR产物与T载体重组、蓝白斑法筛选重组子及目的基因测序鉴定。
（4）pBV-dps-2x-6his融合表达载体的构建及RT-PCR获取真核生物目的基因。
（5）载体pBV-dps-2x-6his与目的基因的重组、Dps融合蛋白的诱导表达、蛋白分离纯化、Dps蛋白功能鉴定。
实验一
分子生物学实验常用仪器设备
【实验目的】
介绍实验的原理和流程；学习常用仪器设备的使用。
【实验器材】
1.**设备
电热鼓风干燥箱主要用于干热**；高压**锅主要用于高压湿热**。
2.离心机
低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段，基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收及其他生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术。
离心机的分类和功能：低速离心机，每分钟几千转（r/min），用于分离细胞；高速离心机，每分钟1万～3万转，用于分离DNA、蛋白质等生物大分子；超速离心机，每分钟3万转以上，用于分离病毒、蛋白质等，根据用途又可分为分析超速离心机和制备超速离心机。
本课题需要实验室配有低温台式高速离心机，分别配有1.5ml和40ml角式转头，极限转速在20000r/min以上。
3.冷冻设备
普通冰箱（4℃，-20℃），-40℃冰箱，-80℃冰箱。许多动物、植物、微生物的样本以及试剂需要在低温或者超低温下贮存。
需配置制冰机，许多反应和实验过程需要在冰浴内进行。
4.凝胶电泳装置
电泳法可以对不同带电物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分提取制备。水平电泳槽常用于对核酸进行琼脂糖凝胶电泳实验，垂直电泳槽多用于蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。电泳仪为电泳提供稳压或稳流的电源。
5.凝胶成像仪
观察凝胶板、进行成像和分析存储成像结果。
6.PCR仪
PCR仪也称DNA热循环仪、基因扩增仪。主要应用在基础研究和应用研究的许多领域，如基因合成、基因分析、序列分析、进化分析、临床诊断、法医学鉴定等。
7.0.1～1000μl的微量移液器
一般都为量程可调移液器，可调范围分别为0.1～2.5μl、0.5～10μl、10～100μl、20～200μl、200～1000μl，用于微量溶液的移取。有不同型号的移液器枪头（tip）适用于不同量程的移液器。
8.超净工作台
超净工作台为分子生物学无菌操作提供了可能，分为垂直送风和水平送风两种。
超净工作台由三相电机作鼓风动力，功率为145～260W，将空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓的“高效的特殊空气”，它除去了大于0.3μm的尘埃、真菌和细菌孢子等。超净空气的流速为24～30m/min，这已足够防止附近空气可能的袭扰而引起的污染，该范围流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等进行的灼烧消毒。工作人员在这样的无菌条件下操作，保持无菌材料在转移接种过程中不被污染。
9.培养箱
包括恒温培养箱和数控恒温振荡培养箱。数控恒温振荡培养箱广泛用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养、发酵、杂交、生物化学反应及酶和组织研究等。
10.天平
包括分析天平和制备天平，天平的精度可达到千分之一或者万分之一。
11.光学测量仪器
紫外-可见分光光度计主要用来检测DNA或RNA的浓度和纯度，有条件的实验室用DNA或RNA计算器来代替分光光度计，使用起来更方便。
12.微波炉及电磁炉
用于熔化琼脂和琼脂糖。
13.pH计（酸度计）
用于试剂配制。
14.磁力搅拌器
用于试剂配制。
15.旋涡混合器
混合微量试剂。
16.水浴装置
常用的水浴温度分别为16℃、37℃、42℃和60℃等，用于重组、酶切、转化、溶胶等分子实验操作。
17.玻璃器皿及塑料制品
大小烧杯、锥形瓶、培养皿（直径9mm）、试剂瓶、量筒、吸管、搅拌棒、研磨器、离心管（1.5ml、0.5ml、0.2ml）、PCR管、不同型号的移液器枪头等。
18.部分常用仪器
19.含质粒的大肠杆菌菌株
20.胰蛋白胨、酵母提取物、氨苄西林（氨苄青霉素）
【实验步骤】
1.了解实验主要流程、时间安排、实验要求等。
2.学习实验室安全注意事项。
3.学习微量移液器的使用（见附录3）。使用各种量程的移液器练习移取1μl、10μl、55μl、150μl和1ml的蒸馏水。
4.学习高压蒸汽**锅、超净工作台、恒温振荡培养箱等的使用（见附录3）。
5.实验器皿的洗涤、**。
6.含质粒大肠杆菌的接种培养。
【注意事项】
1.取液体试剂之前应混匀一下，以免因放置时间过长而浓度不均。
2.移液器用完之后要将刻度调回到接近*大量程的位置，防止弹簧失去弹性。
【问题讨论】
1.分子生物学实验中哪些试剂在使用过程中应特别注意安全防护？
2.简述微量移液器的正确使用方法。
定价：28.0
ISBN：9787030571236
作者：无
版次：1
出版时间：2018-05
内容提要：
本书是科研成果转化而来的、由递进式的实验项目组成的一个综合性课题，课题内容涵盖了重组DNA的基本流程，包含基础实验部分和拓展创新实验部分，共17个实验项目。
目录：
目录
前言
实验室守则 1
实验内容概述 2
实验一 分子生物学实验常用仪器设备 4
实验二 培养基的配制与细菌的纯化培养 7
实验三 质粒的提取 10
实验四 目的基因PCR扩增及扩增产物回收 12
实验五 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 16
实验六 PCR扩增产物与T载体的连接 20
实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备 24
实验八 重组质粒的构建及转化 26
实验九 阳性克隆的筛选鉴定 31
实验十 目的蛋白的诱导表达及检测 36
实验十一 蛋白质印迹法鉴定目的蛋白 41
实验十二 细胞中总RNA的提取 44
实验十三 逆转录PCR获取目的基因 47
实验十四 Dps融合表达载体的构建 49
实验十五 目的基因与融合表达载体重组、Dps融合蛋白诱导表达及检测 55
实验十六 目的蛋白的分离纯化 58
实验十七 目的蛋白的功能鉴定 63
参考文献 68
附录1 常用试剂及其配制 69
附录2 常用实验材料保存方法 80
附录3 常用仪器设备使用说明及使用注意事项 81
附录4 实验时间安排建议 88
附录5 实验小贴士 90
附录6 实验报告格式 91
在线试读：
实验室守则
1.穿着要整洁规范，进入实验室必须穿实验服。
2.实验室内禁止带入食品，勿高声谈话。
3.实验前应当认真预习，熟悉实验内容，了解所用仪器用具；实验应严格按操作规程进行，认真操作、仔细观察，及时记录实验现象及结果；实验结束后，仔细分析和总结实验结果，认真撰写实验报告。
4.许多溶剂，如三氯甲烷（氯仿）、异戊醇、异丁醇、正丁醇、甲醛和乙醚，应在通风橱中使用或使用时注意通风，并注意保护呼吸道、皮肤和衣物。有些试剂可能是致癌物或诱变剂，如溴化乙锭、甲酰胺、丙烯酰胺等，在操作中应注意防护，并注意使用后的处理。注意防止紫外线对皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。
5.各种试剂在使用前都应认真阅读使用说明，特别是一些试剂盒，在掌握相关知识后方可使用。
6.实验室中所有仪器都应向有使用经验的人请教后或阅读仪器使用说明书后方可使用。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障立即报告，不得擅自拆检。仪器使用后使用人要如实填写使用登记表。
7.实验台应当保持整洁，仪器、药品摆放整齐，使用过的器具及玻璃器皿应洗净后放回原处。试剂应规范、节约使用。公用试剂使用完毕后，应立即盖好放回原处。
8.实验结束后整理好自己的实验用品，清理实验区域，做好卫生，并注意实验室水、电、门、窗等方面的安全。
实验内容概述
1.课题名称
大肠杆菌Dps及其融合蛋白表达载体的构建、诱导表达、分离纯化和功能鉴定
2.研究背景和目的意义
DNA结合蛋白（DNA-binding protein from starved cell，Dps）是存在于古生菌及细菌中的一类抗压力蛋白，属于铁蛋白超家族。每一个Dps单体的分子质量为18.7kDa，Dps单体能够通过自组装机制形成十二聚体，发挥多种生理功能，它既能通过亚铁氧化酶活性，结合铁离子对氧化压力做出应答，又能在氧化并储存铁的同时去除H2O2与Fe（Ⅱ）的毒性，从而保护DNA、蛋白质及膜脂免受自由基损伤。另外，在铁、铜、辐射、高盐、酸、碱、饥饿或营养不足等环境胁迫下，一些细菌的Dps还能非特异性结合DNA，形成一个高度有序且稳定的Dps-DNA复合体，使染色体从松散易受损伤形态转变为凝集紧实状态，起到保护DNA免受损伤的作用。
本实验以大肠杆菌（Escherichia coli， E.coli）基因组为模板，对其dps基因进行扩增，并在其下游引入His-Tag，重组到pBV220载体上构建pBV-dps-6his原核表达载体，利用亲和层析分离纯化目的蛋白并通过蛋白质印迹实验进行鉴定；根据蛋白质是否能自组装成十二聚体并与DNA结合、保护DNA免受自由基氧化损伤等特点检测表达蛋白的功能。
在pBV-dps-6his原核表达载体基础上构建pBV-dps-2x-6his原核表达载体，其中2x为引入的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点，可将其他目的基因，如抗原表位序列或通过RT-PCR获得的真核生物基因等插入此位点，诱导表达Dps融合蛋白。
通过基因工程表达的Dps及其融合蛋白，可进行蛋白质抗氧化保护作用、抗原表位的免疫原性等生物学功能方面的研究。本课题内容综合性强，包含了基因工程（重组DNA技术）的关键设计思路和基因操作的常用方法。
3.实验流程图
4.内容模块
基础实验内容：大肠杆菌Dps表达载体的构建、诱导表达及检测鉴定。
（1）质粒和目的基因（dps基因）的获取与检测。
（2）pBV-dps-6his表达载体构建及Dps-6his蛋白诱导表达及检测鉴定。
拓展创新实验内容：Dps融合表达载体的构建、表达蛋白的分离纯化及功能鉴定。
（3）PCR产物与T载体重组、蓝白斑法筛选重组子及目的基因测序鉴定。
（4）pBV-dps-2x-6his融合表达载体的构建及RT-PCR获取真核生物目的基因。
（5）载体pBV-dps-2x-6his与目的基因的重组、Dps融合蛋白的诱导表达、蛋白分离纯化、Dps蛋白功能鉴定。
实验一
分子生物学实验常用仪器设备
【实验目的】
介绍实验的原理和流程；学习常用仪器设备的使用。
【实验器材】
1.**设备
电热鼓风干燥箱主要用于干热**；高压**锅主要用于高压湿热**。
2.离心机
低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段，基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收及其他生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术。
离心机的分类和功能：低速离心机，每分钟几千转（r/min），用于分离细胞；高速离心机，每分钟1万～3万转，用于分离DNA、蛋白质等生物大分子；超速离心机，每分钟3万转以上，用于分离病毒、蛋白质等，根据用途又可分为分析超速离心机和制备超速离心机。
本课题需要实验室配有低温台式高速离心机，分别配有1.5ml和40ml角式转头，极限转速在20000r/min以上。
3.冷冻设备
普通冰箱（4℃，-20℃），-40℃冰箱，-80℃冰箱。许多动物、植物、微生物的样本以及试剂需要在低温或者超低温下贮存。
需配置制冰机，许多反应和实验过程需要在冰浴内进行。
4.凝胶电泳装置
电泳法可以对不同带电物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分提取制备。水平电泳槽常用于对核酸进行琼脂糖凝胶电泳实验，垂直电泳槽多用于蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。电泳仪为电泳提供稳压或稳流的电源。
5.凝胶成像仪
观察凝胶板、进行成像和分析存储成像结果。
6.PCR仪
PCR仪也称DNA热循环仪、基因扩增仪。主要应用在基础研究和应用研究的许多领域，如基因合成、基因分析、序列分析、进化分析、临床诊断、法医学鉴定等。
7.0.1～1000μl的微量移液器
一般都为量程可调移液器，可调范围分别为0.1～2.5μl、0.5～10μl、10～100μl、20～200μl、200～1000μl，用于微量溶液的移取。有不同型号的移液器枪头（tip）适用于不同量程的移液器。
8.超净工作台
超净工作台为分子生物学无菌操作提供了可能，分为垂直送风和水平送风两种。
超净工作台由三相电机作鼓风动力，功率为145～260W，将空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓的“高效的特殊空气”，它除去了大于0.3μm的尘埃、真菌和细菌孢子等。超净空气的流速为24～30m/min，这已足够防止附近空气可能的袭扰而引起的污染，该范围流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等进行的灼烧消毒。工作人员在这样的无菌条件下操作，保持无菌材料在转移接种过程中不被污染。
9.培养箱
包括恒温培养箱和数控恒温振荡培养箱。数控恒温振荡培养箱广泛用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养、发酵、杂交、生物化学反应及酶和组织研究等。
10.天平
包括分析天平和制备天平，天平的精度可达到千分之一或者万分之一。
11.光学测量仪器
紫外-可见分光光度计主要用来检测DNA或RNA的浓度和纯度，有条件的实验室用DNA或RNA计算器来代替分光光度计，使用起来更方便。
12.微波炉及电磁炉
用于熔化琼脂和琼脂糖。
13.pH计（酸度计）
用于试剂配制。
14.磁力搅拌器
用于试剂配制。
15.旋涡混合器
混合微量试剂。
16.水浴装置
常用的水浴温度分别为16℃、37℃、42℃和60℃等，用于重组、酶切、转化、溶胶等分子实验操作。
17.玻璃器皿及塑料制品
大小烧杯、锥形瓶、培养皿（直径9mm）、试剂瓶、量筒、吸管、搅拌棒、研磨器、离心管（1.5ml、0.5ml、0.2ml）、PCR管、不同型号的移液器枪头等。
18.部分常用仪器
19.含质粒的大肠杆菌菌株
20.胰蛋白胨、酵母提取物、氨苄西林（氨苄青霉素）
【实验步骤】
1.了解实验主要流程、时间安排、实验要求等。
2.学习实验室安全注意事项。
3.学习微量移液器的使用（见附录3）。使用各种量程的移液器练习移取1μl、10μl、55μl、150μl和1ml的蒸馏水。
4.学习高压蒸汽**锅、超净工作台、恒温振荡培养箱等的使用（见附录3）。
5.实验器皿的洗涤、**。
6.含质粒大肠杆菌的接种培养。
【注意事项】
1.取液体试剂之前应混匀一下，以免因放置时间过长而浓度不均。
2.移液器用完之后要将刻度调回到接近*大量程的位置，防止弹簧失去弹性。
【问题讨论】
1.分子生物学实验中哪些试剂在使用过程中应特别注意安全防护？
2.简述微量移液器的正确使用方法。