目录

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1基因工程概述 001

1.1基因工程的概念与基本流程 001

1.1.1基因工程的概念 001

1.1.2基因工程的基本流程 002

1.2基因工程的发展简史 003

1.2.1基因工程诞生的背景 003

1.2.2基因工程的诞生 004

1.2.3基因工程的发展 005

1.3基因工程的研究意义和应用 007

1.3.1基因工程在功能基因组学研究中的应用 007

1.3.2基因工程在工业领域的应用 007

1.3.3基因工程在农业领域的应用 009

1.3.4基因工程在医药领域的应用 011

本章小结 013

复习题 013

2基因工程工具酶 014

2.1性核酸内切酶 014

2.1.1性核酸内切酶的发现和种类 014

2.1.2性核酸内切酶的命名 016

2.1.3性核酸内切酶的特征 016

2.1.4性核酸内切酶的同尾酶 019

2.1.5影响性核酸内切酶酶切反应的因素 021

2.1.6性核酸内切酶酶切位点的引入与消失 022

2.2DNA连接酶 024

2.2.1DNA连接酶的作用 024

2.2.2不同末端的连接策略 025

2.2.3影响DNA连接反应的因素 028

2.3DNA聚合酶类 028

2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 028

2.3.2Klenow大片段酶 029

2.3.3耐热的DNA聚合酶Taq 030

2.3.4T4噬菌体DNA聚合酶 031

2.3.5逆转录酶 031

2.4碱性磷酸酶 032

2.4.1碱性磷酸酶防止载体自连 032

2.4.2获得5′末端磷酸基团标记的探针 035

2.5末端脱氧核苷酸转移酶 036

2.6其他工具酶 037

2.6.1Ⅱs型性核酸酶 037

2.6.2Cas核酸内切酶 038

2.6.3Dicer酶 040

2.6.4重组酶 041

本章小结 043

复习题 043

3基因工程载体 044

3.1克隆载体 044

3.1.1质粒载体 045

3.1.2噬菌体载体 052

3.1.3黏粒载体 057

3.1.4人工微小染色体 057

3.2表达载体 059

3.2.1原核表达载体 060

3.2.2真核表达载体 071

本章小结 075

复习题 075

4目的基因的获取与制备 077

4.1从基因文库获取目的基因 078

4.1.1基因组文库的构建与筛选 078

4.1.2cDNA基因文库的构建与筛选 082

4.2电子克隆法获取目的基因 091

4.2.1利用EST数据库进行电子克隆 092

4.2.2利用基因组数据库进行电子克隆 093

4.2.3全长cDNA 的判断 094

4.2.4电子克隆基因的生物信息学分析 094

4.3PCR 获取与扩增目的基因 095

4.3.1常规PCR 095

4.3.2反向PCR 102

4.3.3反转录PCR 103

4.3.4实时荧光定量PCR 105

4.3.5多重PCR 110

4.3.6巢式PCR 112

4.3.7不对称PCR 112

4.3.8RACEPCR 113

4.3.9原位PCR 115

4.4通过蛋白质工程改建目的基因 116

4.4.1蛋白质工程的概念 116

4.4.2蛋白质工程的定点突变技术 116

4.4.3蛋白质工程的定向进化技术 120

本章小结 123

复习题 124

5目的基因导入受体细胞的方法 125

5.1把目的基因导入大肠杆菌 126

5.1.1自然条件下的转化过程 126

5.1.2感受态受体细胞的选择 128

5.1.3外源目的基因转化进入大肠杆菌细胞的方法 129

5.1.4外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞 131

5.2把目的基因导入酵母细胞 133

5.2.1聚乙二醇介导的酵母转化 133

5.2.2金属阳离子介导的酵母转化 134

5.3把目的基因导入植物细胞 134

5.3.1DNA直接转移法 134

5.3.2农杆菌Ti质粒载体介导法 137

5.4把目的基因导入动物细胞 141

5.4.1外源基因导入离体培养的动物细胞 141

5.4.2外源基因导入在体动物细胞 144

本章小结 147

复习题 147

6阳性转化子的鉴定 148

6.1遗传表型检测法 148

6.1.1利用载体提供的表型特征筛选和鉴定重组DNA分子 149

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